基于纳米孔的DNA计算技术检测microRNA表达模式的方法

miRNA是一类小分子量的非编码RNA片段，通过与靶向mRNA结合，发挥基因沉默和翻译抑制的功能。miRNA通过调控生物体一系列的生长发育过程，可以帮助生物体应对各种各样的环境变化，维持正常的生命活动。因此，理解miRNA的发生调控过程，尤其是miRNA在不同组织、不同生长发育时期、不同生理状态时的含量，显得尤为重要。

纳米孔检测技术作为20世纪90年代中期发展至今的一种分析手段，因为其无标记、高灵敏等优势，已经逐渐成为化学、生物学领域内一种重要的单分子级别的分析检测方法。而基于纳米孔的核酸分析是纳米孔检测领域中最成功的方向，尤其是基于纳米孔测序方法开发的第三代测序技术已经被广泛地应用于生命科学领域的研究中。因此，纳米孔检测技术有望在miRNA的分析检测中做出独特的贡献。

近期，来自东京农工大学的Ryuji Kawano教授在JACS Au上发表了题为“Pattern Recognition of microRNA Expression in Body Fluids Using Nanopore Decoding at Subfemtomolar Concentrations”的文章，提出了一种使用发夹DNA探针的miRNA检测方法，理论上实现了胆管癌样本中阿摩尔水平（10⁻¹⁸M）的miRNA检测。

研究人员使用的实验装置如图1a、b所示，选择miR-193、miR-106a、miR-15a、miR-374和miR-224作为靶标miRNA，因为这些miRNA已经被报道在人的胆管癌细胞中过表达。接下来，研究人员设计了一条可以与这五种miRNA互补配对的5’端含发夹结构的单链DNA-HP-dgDNA（图1c），HP-dgDNA和miRNA配对后的热力学模拟结构如图1d所示。当与miRNA杂交的HP-dgDNA通过αHL纳米孔时，互补配对的双链区域在电压驱动下发生解旋，且解旋时间随着互补配对位置个数减少而减少（图1e），因此，可以通过杂交链的解旋过孔时间来大致判断有几种miRNA与HP-dgDNA发生互补配对。

为了验证该检测方法的可行性，研究人员首先使用合成miRNA分别制备了胆管癌miRNA样品（存在5种miRNA）和两种健康的miRNA样品（存在1或3种miRNA）。三种样品分别与HP-dgDNA杂交，含1种（图2a）、3种（图2b）或5种（图2c）miRNA样品的过孔时间如图所示。其统计结果如图2d所示，可以看到含有3种或5种miRNA互补的杂交链解旋过孔时间明显长于只含1种miRNA的过孔时间，五类只含1种miRNA的杂交链过孔时间也在统计上存在一点区分（图2d，f），并且所有含miRNA的杂交链的过孔时间都大于HP-dgDNA单链的过孔时间（图2e）。同时，根据模拟的结果，研究人员还发现杂交链过孔时间是随着杂交链解旋所需能量增大而延长的（图2g）。研究人员在图2中验证了可以利用杂交链解旋过孔的时间差异来区分与HP-dgDNA杂交的miRNA数量差异，从而汇报出样品中miRNA大致的种类。

在验证了方法的可行性后，研究人员测试了该方法针对临床样本的有效性。尽管miR-15a、miR-193、miR-224、miR-106a和miR-374这五种miRNA已经被报道在胆管癌患者中过表达，研究人员仍然先使用RT-qPCR对从血浆样品中提取的miRNA进行定量（图3a，b），可以发现相较于健康人而言，癌症患者中这五种miRNA的表达量都较高，其中miR-193，miR-106a和miR-15a的表达量显著高于健康水平。随后，研究人员使用纳米孔传感了从血浆中提取的miRNA与HP-dgDNA的杂交链（图3c），可以看到癌症患者中提取到的miRNA与HP-dgDNA形成杂交链的解旋过孔时间（1487ms）明显长于健康人（856ms）提取到的miRNA杂交链的过孔时间（图3e，f）。图3说明了可以根据杂交链的过孔时间来区分癌症患者与健康人的miRNA表达量差异。

最后，研究人员探究了该方法理论上的检测限。分别使用0.1、1、10和100fM的miRNA与500nM HP-dgDNA杂交（图4b，c），可以发现小于100fM的miRNA杂交链过孔时间随着浓度提高而增加，且都大于仅存在HP-dgDNA单链的过孔时间（图4f）。因此，研究人员认为只要miRNA杂交链的过孔时间稍大于HP-dgDNA单链的过孔时间都可以被认为实现了检测，通过理论计算可以得到该方法的理论检测限为0.3fM。

该论文一经发表就受到领域的广泛关注，上线不到一个月时间Altmetric指标就达到了92，但是不可否认的是，相较于如此高的关注度，该方法仍然有很多问题亟待解决，如：1）过时间被判断为可区分的差异程度没有定义，很多拟合峰相互重合；2）血浆中提取miRNA是否会因为除了这五种miRNA以外的其他miRNA与单链DNA部分互补从而影响了过孔时间；3）癌症患者的过孔时间统计分布与健康人基本相同，该方法对患者之间的差异对疾病诊断的影响。

作者：Nanami Takeuchi， Moe Hiratani， and Ryuji Kawano*