几种典型的大视场光学显微成像技术及生物医学应用

摘要：光学显微成像技术具有实时、高分辨率和非侵入性等特点，其成像尺度可跨越细胞、组织乃至生命体，极大地拓展了人们对生命本质的认识边界。然而，受限于光学显微成像系统有限的空间带宽积（Space-bandwidth Product，SBP），常规的光学显微镜难以同时兼顾视场大小和分辨率，使得显微成像在大视场生物成像应用中受到较大的限制，例如对脑神经网络以突触为单位的神经回路成像。近年来，大视场光学显微成像技术得到不断的发展，其SBP相较于传统的光学显微镜有了十倍甚至百倍的提升，在保持高分辨率的基础上拓展了成像视场，满足了生物医学领域重大问题的研究需求。本文介绍了近年来几种典型的大视场光学显微成像技术及其生物医学应用，并对其未来发展做了展望。

关键词：光学显微；空间带宽积；大视场成像；活体成像

1. 引言

光学成像系统的信息通量常用空间带宽积（Space-Bandwidth Product，SBP）来衡量，SBP是一个无量纲数，可以理解为系统视场（Field of view，FOV）内可分辨的像素点个数， SBP越大，系统可传输的信息就越丰富。常规的光学显微镜，其成像的SBP在数百万量级。系统的SBP提升主要受两个因素限制：一是探测器的像素尺寸和像素数量，目前随着以sCMOS为代表的大尺寸高分辨率相机的发展，探测器的像素数已经可以达到2×107,像素尺寸1.5 μm，因此探测器已不再是系统SBP的瓶颈；二是成像光路，主要受制于显微系统的成像物镜。常用的商业显微物镜，其SBP在不考虑离轴像差影响的情况下，一般不超过107，因此提升成像光路的SBP是提升整个系统大视场光学显微成像能力的有效途径。

提升系统SBP的基本思路有两种，简单来说，就是在保持分辨率的基础上，扩大视场；或者在维持视场的基础上，提升分辨率。目前，光学显微系统的分辨率分布在高至衍射极限的约200 nm，低至数个μm范围内，由物镜的数值孔径（Numerical Aperture，NA）和工作波长λ决定。在实际应用中，分辨率可提升的范围有限，以荧光显微成像中的结构光照明技术（Structured Illumination Microscopy，SIM）为例，使用线性结构光照明样品的方法最多可以将分辨率提升一倍，虽然使用非线性结构光可以实现更高的提升倍率，然而强烈的光损伤使这一方法并不常用，且实际可提升的倍数也有限。与之相似的还有傅里叶叠层显微技术（Fourier Ptychography Microscopy，FPM），通过频域多角度照明的方法实现视场内分辨率的数倍提升。因此，利用分辨率提升的措施使SBP达到十倍百倍的提升，并不现实。 而基于扩大成像视场，进而提高获取图像像素数的方法，已经得到了有效的验证。一个常用的做法是用高NA，小视场的成像物镜，对样品做多次成像，再用二维互相关技术等将各子视场的图像拼接，实现高分辨率的超大视场图像获取。这一方法在组织切片成像，病理诊断等领域已得到广泛应用。拼接成像的优势在于这一技术非常成熟，系统相对简单。电动样品位移台可以实现样品微米级精度的二维或三维移动，物镜扫描系统和自动对焦算法也可以使物镜在样品每次移动后自动对焦并成像。因此无论是用现有显微镜改造，还是购置新品，实现拼接的大视场成像均不困难。然而，对于拼接成像技术，由于其每个子视场在时间上和空间上的采集都是离散的，因此需要更多的采集时间，这些时间更多的被用于样品移动和物镜对焦，而不是光子采集。长时间采样时，来自温度的变化或环境的振动有可能导致样品离焦以及产生运动伪影，高NA的物镜对于环境变化则更为敏感。此外，较长的采样时间也限制了这一方法的应用范围，如大视场的生物样本实时动态检测。

因此，提升分辨率或者是拼接成像的方法对成像系统SBP的提升都存在各自的弊端：前者的提升能力有限，难以满足大视场光学显微生物成像的需求；后者耗时太长，不适用于快速的在体观测。一类有效的解决办法是直接扩大成像视场来提升SBP，它可以在较短的时间内获取高像素数图像。需要注意的是，系统的SBP受空间分辨率和视场范围影响，会决定单次成像的像素数上限，而系统的实际像素数还会受到探测器的限制，因此探测器的选型需要和系统设计匹配。

图1. 大视场物镜双光子脑成像。(a)成像系统光路图和物镜实物图（左上）；(b) 活体鼠脑神经细胞的双光子成像，深度为150 μm；(c) (b)中虚线框内的细节放大图。

图2. 基于散斑光片照明的大视场成像系统[25]。(a) 系统光路示意图，激光经ground glass disk形成的散斑图案投影在体积为4.4×3×3 mm3的样品内，形成厚度约为3 μm的散斑光片照明；(b) 用光片照明模式实现斑马鱼全身成像；(c)用共聚焦模式实现的斑马鱼全身成像。

图3. 微透镜的排列与扫描方向示意

图4. 阵列显微系统[39]。(a) 阵列显微系统光路设置；(b) 小鼠肾脏切片的高通量成像；(c) (b)中红色框内的放大图。

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4. 总结 综上所述，高SBP显微成像仪的发展路线多样，在性能上也各自取得了很好的突破。基于透镜成像的三种系统实现SBP的突破相对更复杂，成本更高，但成像的保真度更高，应用场景更广；而基于无透镜计算成像的片上显微实现SBP的突破更简单，更直接，对算法和传感器技术进步的依赖更强，但是其分辨率和成像保真度均有待进一步提升，应用场景相对受限。目前，高SBP显微成像仪多用于宽场成像，其与相对成熟的各类成像模态（双光子，超分辨等）、制样技术（组织光透明，层切，膨胀等）的合理搭配，将会使它的应用场景得到有力的拓展，文中也介绍了一些成功的实践案例。除了以上提到的四类光学显微成像技术外，光学相干层析（Optical Coherent Tomography, OCT）、光声显微成像等也在大视场成像领域取得了很好的成果，其成像原理虽有差异但实现大视场显微成像的方法相似——多次扫描与应用高SBP成像物镜等。目前大视场光学显微成像技术仍普遍面临成像帧率这一瓶颈，但随着传感器性能和计算机技术的进步，这一问题也必将获得有效的解决，有望为大视场显微生物成像提供更好的工具选项。

审核编辑：彭静