mTORC1高活性的干细胞样状态肿瘤细胞类型分析

干细胞样肿瘤细胞的Midkine表达驱动mTOR

抑制和免疫抑制微环境的持续

（一）

摘要

mTORC1在多种癌症类型中异常活跃。此研究对结节性硬化综合症(TSC)与mTORC1极度活跃相关的肿瘤进行了单细胞转录组分析、配对T细胞受体(TCR)测序和空间转录组分析，并通过肿瘤调节的免疫抑制性巨噬细胞确定了一种与T细胞功能障碍有关的干细胞样肿瘤细胞状态（SLS）。雷帕霉素及其衍生物(rapalogs)是治疗TSC肿瘤的主要药物，干细胞样肿瘤细胞在体外表现出雷帕霉素耐药，这让研究者联想到这些药物对患者细胞的抑制作用。促血管生成因子midkine (MDK)在SLS群体中高度表达，并在SLS优势样本中与内皮细胞的富集相关。MDK抑制与雷帕霉素在体内外协同抑制TSC细胞系的生长。综上所述，本研究提示mTORC1高活性的干细胞样状态肿瘤细胞通过免疫抑制，存在一种自分泌雷帕霉素耐药机制和旁分泌肿瘤生存机制。

研究内容

AML 和 LAM的单细胞分析

研究者对肿瘤切除时获得的6个肾性AML肿瘤和4个正常组织进行scRNA-Seq和scTCR-Seq（图1a）。在肺移植时获得的5个LAM组织也进行了scRNA-Seq。过滤掉低质量的细胞后，共分析了来自AML的108,071个细胞和来自匹配的正常肾脏的33,136个细胞；分析了LAM肺部样本的42,202个细胞。AML组织和正常组织的免疫和基质区的主要细胞类型见图1b, c。正常肾脏含有49%的上皮细胞，而AML中只有1.1%的上皮细胞（图1d）。与正常组织相比，许多免疫类细胞在肿瘤组织中被富集，包括巨噬细胞（18.3% vs 2.7%）、树突状细胞（4% vs 0.7%）和T细胞（32.6% vs 14.1%）。在LAM组织中发现的主要细胞类型包括免疫细胞（T细胞、NK细胞、B细胞、巨噬细胞和单核细胞）、间质细胞、上皮细胞和内皮细胞（淋巴细胞和血液）（图1e）。

AML细胞中的通路和遗传调控网络的图谱

对间质细胞群的重新聚类显示了来自正常肾组织和AML肿瘤组织的独立细胞群（图1f）。除了AML细胞（如上所述），该集群还包含肿瘤相关的成纤维细胞（TAF）。通过Seurat的差异基因表达分析发现，与TAF和正常肾脏相比，160个基因在肿瘤细胞中唯一上调，包括以前报道的基因（如GPNMB、SQSTM1/p62、MMP2、PTGDS）和参与肿瘤转移的基因（如MMP11、MDK、DCN、PDPN）（图1g，补充图3b，补充数据1）。与匹配的正常间质细胞相比，两个长的非编码RNAs（lncRNAs）（MALAT1，NEAT1）在肿瘤细胞和肿瘤相关的成纤维细胞中都被上调（图1g和补充图3c），表明AML细胞重塑了成纤维细胞。为了确定AML细胞与TAF和正常肾脏的不同调节途径，研究者使用了基因集变异分析（GSVA）。标志性的基因集分析（包含50个基因集）确定了参与胆固醇平衡的基因是AML细胞中上调最多的途径，而第二大上调途径是mTORC1信号传导，这是在AMLs和LAM中TSC2损失的一个众所周知的生化效应（图1h）。研究者使用SCENIC分析发现：在AML细胞中更多的调控因子被上调。该分析还确定了与AML相关的转录因子和调节子，包括参与表观遗传调控的几个因子，如HDAC2、SIRT6、FOXN3、MEF2A（图1i，补充图3d。补充资料2、3）。所关注的具体基因包括MDK（在此新发现的在AML中高表达的基因）和GPNMB（AML的一个已知标记）。研究者使用RNA原位杂交，在AML肿瘤中检测到MDK的表达，但在邻近的正常肾脏中没有检测到（图1j）。MDK是一种肝素结合的生长因子，能促进细胞生长和血管生成。

图1. 血管肌瘤（AML）和淋巴管瘤病（LAM）的单细胞图谱

AML肿瘤细胞表现为两种主要状态:干细胞样和炎性

对6596个AML细胞进行重新聚类显示了四个细胞群（图2a，b）。Custer 1显示中胚层特异性转录因子21（TCF21）的相对高表达，这是平滑肌细胞表型调节的主调控因子（图2b，补充图4b）。他们注意到几个基因（SOX4，TCF4）（图2b，补充图4c），已知是干细胞标志物。研究者计算 "干性评分"并发现：群组1显示出最高的干性分数（图2c），并显示出炎症基因的高表达（图2b，补充图4e）。基于这些特征，他们将聚类1定义为干细胞样状态（SLS），聚类2定义为炎症状态（IS）。嘌呤相关的代谢与mTORC1途径有关，高水平的嘌呤核苷酸是维持癌症干性所必需的，而外部补充次黄嘌呤则会促进肿瘤干性。研究者从单细胞转录组中产生了伪Bulk RNA-seq数据，并发现与正常对照组相比，两种肿瘤细胞状态下嘌呤途径中鸟嘌呤/鸟苷的代谢都升高了（图2d）。

人们越来越认识到，缺氧的微环境以及转移过程中诱发的压力会引发休眠状态，使肿瘤细胞对药物治疗和压力产生抗性。研究者进一步分析一组休眠标记基因，发现在SLS群体中高表达（群集1），包括转录因子NR2F1（图2e）。NR2F1通过整合静止和生存的表观遗传程序，成为诱导和维持肿瘤干细胞休眠的一个关键节点。Regulon分析证实，NR2F1 regulon活性在SLS（群集1）中被上调（图2f）。并且雌二醇处理增加了NR2F1的表达和regulon活性（图2g）。研究者通过对SLS和IS的marker（MDK和TAGLN，图2i）以及Cathepsin K（AML/LAMmarker基因）进行共染色，在肿瘤样本中鉴定到了SLS和IS群体。量化显示MDK和TAGLN几乎没有共定位，而MDK与CTSK或TAGLN与CTSK广泛共染（图2j），支持存在两个不同的AML细胞群，MDK+和TAGLN+。

LAM中出现的细胞群与AML中观察到的两种类型相似

遗传学研究显示，AML和LAM的细胞来自一个共同的前体细胞。为了确定在AML中发现的两种细胞状态是否存在于肺部LAM中，研究者使用与AML相同的标记基因组和方法分析了五个LAM肺部的57186个细胞，共鉴定了375个LAM细胞（图1e）并聚类成了4个细胞群（图2k）。与AML相似，一个集群表达SLS/调节性平滑肌标志基因（集群2），另一个集群表达IS/收缩性平滑肌标志基因（集群1）（图2l）。还确定了一个表达所有这些基因的中间状态（簇0）。SLS群体和中间状态显示出较高的干性评分（图2m）。此外，与SLS AML细胞一样，LAM细胞的SLS群也有NF2F1表达和调节子活性的上调（图2n）。在LAM细胞中，VEGFD（一种有效的LAM生物标志物）的表达远远低于MDK（一种有效的血管生成和淋巴管生成的生长因子）（图2o），表明MDK在LAM相关的淋巴管生成中的潜在作用。

图2. AML和LAM细胞状态的异质性

未完待续

那么AML细胞的干细胞样细胞群与雷帕霉素耐药相关性、异质性肿瘤细胞状态对内皮细胞的重塑以及scRNA-Seq和scTCR-Seq的综合分析如何揭示了SLS优势肿瘤的T细胞功能障碍和抑制的克隆扩展请见下回详解。

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审核编辑：彭静