简介
核糖核酸(缩写为RNA,即RibonucleicAcid),存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。RNA由核糖核苷酸经磷酸二酯键缩合而成长链状分子。一个核糖核苷酸分子由磷酸,核糖和碱基构成。RNA的碱基主要有4种,即A腺嘌呤、G鸟嘌呤、C胞嘧啶、U尿嘧啶,其中,U(尿嘧啶)取代了DNA中的T。
原理细胞中的RNA可以分为信使RNA、转运RNA和核糖体RNA三大类,不同组织总RNA提取的实质就是将细胞裂解,释放出RNA,并通过不同方式去除蛋白,DNA等杂质,最终获得高纯度RNA产物的过程。
仪器及试剂
美析UL-1000超微量可见分光光度计
离心管 离心机 电泳槽 凝胶板
细胞样品
RNA提取试剂盒 荧光定量PCR Mix TRIZOL dNTP氯仿 逆转录酶MMLV异丙醇Taq酶DEPC水ddH2O TE MgCl2琼脂糖 溴化乙锭MOPS甲醛 乙酸钠EDTA EB溴酚兰
样品RNA的抽提
1. 取冻存已裂解的细胞,室温放置5分钟使其完全溶解。
2. 两相分离 每1 ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2 ml的氯仿,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后,15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12 000 rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相,中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
3. RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后15到30℃孵育10分钟后,于4℃下12 000 rpm离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
4. RNA清洗 移去上清液,每1 mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1 ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀。混匀后,4℃下7 000 rpm离心5分钟。
5. RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
6. 溶解RNA沉淀 溶解RNA时,先加入无RNA酶的水4 0ul用枪反复吹打几次,使其完全溶解,获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
RNA质量检测
1.紫外吸收法测定
先用稀释用的TE溶液将紫外分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后,读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值,测定RNA溶液浓度和纯度。
(1)浓度测定
A260下读值为1表示40 ug RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为:A260x稀释倍数x 40 ug/ml。具体计算如下:
RNA溶于40 ul DEPC水中,取5 ul,1:100稀释至495 ul的TE中,测得A260= 0.21
RNA浓度= 0.21 x 100 x 40 ug/ml = 840 ug/ml或0.84 ug/ul
取5 ul用来测量以后,剩余样品RNA为35 ul,剩余RNA总量为:
35 ul x 0.84 ug/ul = 29.4 ug
(2)纯度检测
RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度,比值范围1.8到2.1。
2. 变性琼脂糖凝胶电泳测定
(1)制胶
1 g琼脂糖溶于72 ml水中,冷却至60℃,10 ml的10 x MOPS电泳缓冲液和18 ml的37%甲醛溶液(12.3 M)。
10x MOPS电泳缓冲液
浓度 成分
0.4 M MOPS,pH 7.0
0.1 M 乙酸钠
0.01 M EDTA
灌制凝胶板,预留加样孔至少可以加入25μl溶液。胶凝后取下梳子,将凝胶板放入电泳槽内,加足量的1xMOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。
(2)准备RNA样品
取3 ugRNA,加3倍体积的甲醛上样染液,加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10 ug/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。
(3)电泳
上样前凝胶须预电泳5 min,随后将样品加入上样孔。5-6 V/cm电压下2 h,电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3 cm。
(4)紫外透射光下观察并拍照
28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提RNA的物种类型),上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带,它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖体RNA)组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质,可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染,将会在28S核糖体RNA带的上面出现,即更高分子量的弥散迁移物质或者带,RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。
结果计算
RNA得率有很强的组织特异性,不同组织RNA的丰度和RNA提取的易难程度共同决定了该种组织的RNA得率。一般来说,可通过分光光度计测定RNA溶液在260nm处的吸光值来计算RNA的含量。RNA溶液在260、320、230、280nm下的吸光度分别代表了核酸、溶液浑浊度、杂质浓度和蛋白等有机物的吸收值。用标准样品测得在波长260nm处,1ug/mlRNA钠吸光度0.025(光程为1cm),即OD260=1时,样品中RNA浓度为40ug/ml。通常分光光度计OD260的读数要介于0.15-1.0之间才是可靠的。因此RNA提取结束后,要根据大概产量稀释到适当浓度范围,再用分光光度计检测。按下面的共识计算总RNA浓度:
总RNA浓度(ug/ml)=OD260×稀释倍数×40ug/ml
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上海美析仪器有限公司(以下简称美析),是一家具有自主知识产权的高新技术企业,美析的创业理念“科技——因你改变”,并以此为企业宗旨,不断探究、果敢创新。特别是在分析测试仪器领域,不断开发出先进的产品,使美析成为优质仪器资源的供应者。
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美析的总部及生产基地设在上海,营销中心设在北京,并在江苏、上海、山东三地建有研发基地。为充分利用各地的智力资源,美析与国内外的部分科研单位也进行了深层次的科研合作,不断将科研成果转化为生产力。为更好的服务于广大客户,美析仪器国内设有12家办事机构,度身定制符合您需求的应用解决方案,提高产品的附加值。在不断服务国内用户的同时,美析也与20多个国家的分销机构建立了深度的战略合作关系。
(美析仪器不仅仅只是一家高新技术认证企业,更通过了CE认证、FCC认证、RoHS认证以及国内多项资质审查认证,并有着多项自行研发的光谱类专利版权等等)
审核编辑 黄昊宇
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