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超平整石墨烯电镜载网利于高信噪比和高分辨率的冷冻电镜成像

led13535084363 来源:光行天下 作者:光行天下 2022-12-20 10:32 次阅读

单颗粒冷冻电镜技术是揭示生物大分子精细结构和反应机理的重要手段之一。在样品制备过程中,均匀薄冰层的制备能够显著提高冷冻电镜成像质量,尤其是对于分子量较小的生物大分子(小于100 kDa),因为冰层过厚会严重影响信噪比,无法实现高分辨率结构重构。然而,样品冰层的厚度和均一性难以精确控制,是目前高分辨冷冻电镜成像的主要挑战之一。

北京大学彭海琳教授课题组与清华大学王宏伟教授课题组,以及北京大学韦小丁教授课题组合作,揭示了冷冻电镜样品支撑膜的表面粗糙度和冰层均一性的关系,并开发了超平整石墨烯电镜载网,解决了均匀薄冰的制备难题。实验表明,超平整石墨烯支撑膜有助于制备更薄更均匀的玻璃态冰,背景衬度低,有利于高信噪比和高分辨率的冷冻电镜成像。使用超平整石墨烯支撑膜,他们对三种分子量较小的蛋白质——链霉亲和素蛋白(52 kDa)、血红蛋白(64 kDa)和甲胎蛋白(67 kDa)进行结构解析,分别得到了2.22a74b590-7f8e-11ed-8abf-dac502259ad0.png、3.52a74b590-7f8e-11ed-8abf-dac502259ad0.png和2.62a74b590-7f8e-11ed-8abf-dac502259ad0.png的高分辨率重构。他们还证明该超平整石墨烯载网在冷冻电子断层扫描重构(cryo-ET)等领域有良好的应用前景。    

研究团队基于超平整石墨烯单晶晶圆和“面对面”超洁净无胶转移方法,成功实现了超平整悬空石墨烯电镜载网的批量化制备,单层石墨烯悬空膜完整度高达98%,平均表面粗糙度低至0.7nm。原子力显微镜纳米压痕技术的力学表征结果表明,超平整石墨烯支撑膜具有接近于石墨烯理论值的杨氏模量和断裂强度,远高于粗糙起伏的石墨烯支撑膜。

他们将超平整石墨烯载网用于冷冻电镜成像中,发现均匀薄冰能显著提高成像质量。一方面,超平整悬空石墨烯的预应力使得冰层在电子束辐照下不易发生翘曲,有效抑制了样品颗粒在成像时的漂移。另一方面,在不同的倾转角度下(-60°至60°),石墨烯表面均无褶皱结构,避免了高角度成像时褶皱对样品信号的遮蔽。经过测量,利用超平整石墨烯支撑膜所制备的冰层厚度约为20nm,比较均匀,既可有效封装生物大分子颗粒,也不会过多引入额外的背景噪音。并且,大多数生物大分子颗粒吸附于石墨烯表面,几乎处于同一高度,降低了成像时同一视野下局部欠焦值的差异。与粗糙起伏的石墨烯对比,超平整石墨烯支撑膜保证了高质量数据的收集,提升了成像效率。

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图1.悬空石墨烯支撑膜的平整度影响冰层厚度均一性和成像质量

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图2.超平整石墨烯载网的设计、制备与力学性质表征

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图3.超平整石墨烯显著提高冷冻电镜成像质量,成功解析小分子量蛋白的高分辨三维结构

该研究以“超平整石墨烯制备均匀薄冰用于高分辨冷冻电镜成像”(Uniform thin ice on ultraflat graphene forhigh-resolution cryo-EM)为题,于12月15日发表在《自然·方法学》(Nature Methods)。北京大学化学与分子工程学院彭海琳教授、清华大学生命科学学院王宏伟教授和博士后刘楠,以及北京大学工学院韦小丁教授为论文共同通讯作者,北京大学化学与分子工程学院博士毕业生郑黎明、清华大学生命科学学院博士后刘楠、北京大学化学与分子工程学院2020级博士生高啸寅以及北京大学工学院博士毕业生朱文清为论文共同第一作者。

审核编辑:郭婷

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原文标题:超平整石墨烯用于高分辨冷冻电镜成像

文章出处:【微信号:光行天下,微信公众号:光行天下】欢迎添加关注!文章转载请注明出处。

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