一种基于液滴微流控的高通量单细菌细胞RNA测序法介绍

单细胞RNA测序（scRNA-seq）方法自2005年创立以来，已广泛应用于真核生物领域。目前流行的基于液滴的scRNA-seq系统（如10×Genomics Chromium平台）的关键策略是利用液滴微流控技术将单细胞与唯一的DNA条形编码珠子共同封装在液滴中，随后由珠子上数十亿份唯一的条形编码poly(T)引物捕获多聚腺苷酸化的mRNA。

然而，这种策略与细菌的单细胞RNA测序并不兼容。其中一个主要原因是细菌mRNA缺乏3′端poly(A)尾部，而这正是poly(T)引物的捕获位点。此外，典型细菌的RNA含量比典型哺乳动物细胞低两个数量级，核糖体RNA（rRNA）占细菌总RNA的80%以上，这使得在单个细菌细胞水平上有效捕获和区分这些低含量mRNA变得十分困难，坚韧的细胞壁也使细菌难以裂解并释放液滴中的RNA。

为了解决这些问题，人们开发了一些相对低通量的单细菌RNA测序方法，这些方法需要使用单细胞操纵器或荧光激活细胞分选术（FACS）将单细菌分离到多孔板中。之前开发的两种细菌RNA测序方法“PETRI-seq”和 “microSPLiT”使用随机反转录（RT）引物，使研究人员能够通过分割池条形码策略同时分析数千个固定细菌，这极大地增强了大规模研究细菌群落转录组异质性的能力。然而，这种组合式分裂池条形码策略需要在96孔板中进行多次反应，而96孔板并不是高通量单细胞RNA测序的常用或灵敏平台。此外，即使富集了mRNA，PETRI-seq和microSPLiT中的大部分映射读数也是rRNA，这导致了相当高的测序成本。

为了解决上述问题，近期，浙江大学王永成研究员课题组在Nature Communications杂志上发表了题为“Droplet-based high-throughput single microbe RNA sequencing by smRandom-seq”的研究论文，报告了一种基于液滴的高通量单细菌RNA测序方法“smRandom-seq”。

在这项工作中，研究人员利用随机引物原位生成互补DNA（cDNA），利用液滴微流控技术进行单细菌条形码编码，并利用基于CRISPR的rRNA去除法进行mRNA富集，在此基础上开发了一种高通量、高灵敏度的单细菌RNA测序方法“smRandom-seq”。

图1 基于液滴微流控的smRandom-seq测序方法

smRandom-seq具有条形码效率高、物种特异性高（99%）、交叉污染小（1.6%）和自动化能力强等特点。基于CRISPR的rRNA去除法显著降低了rRNA百分比（83%-32%）。由于高效的rRNA去除法，大肠杆菌的映射mRNA读数高度富集，增加了4倍（16%-63%）。在约8000个大肠杆菌群体中，每个细菌可检测到约1000个基因。研究人员还验证了smRandom-seq可用于其他常见细菌物种，包括革兰氏阴性菌（鲍曼不动杆菌、肺炎双球菌和铜绿假单胞菌）和革兰氏阳性菌（枯草杆菌和金黄色葡萄球菌）。



图2 使用参考细菌样本验证smRandom-seq测序方法的可行性

研究人员还发现大肠杆菌群在抗生素作用下表现出形态异质性，并进行 smRandom-seq以研究单个细菌的这些转录组变化，smRandom-seq对基因表达的聚类分析结果与形态特征一致。大肠杆菌的一些亚群显示出不同的SOS响应和代谢通路基因表达模式，这可能是抗生素耐药亚群。

图3 利用smRandom-seq测序方法捕获单个大肠杆菌在抗生素胁迫下的转录组变化

总之，“smRandom-seq”测序方法提供了一种高通量单细菌转录组图谱分析工具，它将促进未来在细菌耐药性、持久性、细菌-宿主相互作用和微生物组研究方面的发现。





审核编辑：刘清