通过显微光谱对单线态氧进行实时成像

介绍

氧分子是维持生命以及生命灭绝和材料破坏机制中最重要的分子之一。几十年来，研究人员一直对分子氧的最低激发态单线态氧 (1O2)的物理和化学性质很感兴趣。特别是，单线态氧具有独特的反应性，可以导致聚合物降解或生物细胞死亡。它作为细胞死亡中间体的作用被癌症光动力疗法 (PDT)所利用，该技术将光用作医疗工具。

PDT是将光敏剂(PS)掺入异常组织，然后用可见光照射，使其通过II型光化学途径将能量传递给基态氧，产生单线态氧(可以通过其微弱的1270 nm直接检测到)排放)。 由于对阐明单线态氧在亚细胞水平上的生化作用的特殊兴趣，已经提出了几种高空间分辨率方法来使用单个光电倍增管( PMT)、线性InGaAs探测器阵列、或二维InGaAs探测器。

在本应用说明中，查尔斯大学(捷克共和国布拉格)的 Marek Scholz 博士对使用 Princeton Instruments 的NIRvana:640 InGaAs 相机的新型显微光谱装置进行了评估。Scholz 博士报告说，新型 NIRvana ®相机的二维 InGaAs 阵列使他本人和 Jan Hála 教授领导的光学光谱小组的其他成员能够解决1O2磷光与NIR 扩展的潜在光谱重叠问题。 PS 的发光，从而首次提供了区分和分离它们的有效手段。

实验装置

该实验装置利用两个检测通道(VIS和NIR)对单线态氧和光敏剂的非常弱的近红外磷光以及光敏剂的可见荧光同时进行实时成像。这种创新装置(见图 1)能够采集基于单线态氧和单个细胞光敏剂发光的光谱图像。图像的一个维度是空间维度，另一个维度是光谱维度，涵盖 500 至 1700 nm 的光谱范围。

图 1：NIR 发光显微光谱设置：图的下部描绘了 VIS 和 NIR 路径检测到的光谱区域。

DOI：10.1039/c4pp00121d – 经英国皇家化学学会 (RSC) 代表欧洲光生物学会、欧洲化学协会和 RSC 许可复制。

如图 1 所示，直接实时成像装置围绕奥林巴斯倒置荧光显微镜构建，并使用 405 nm 恒定波长 (CW) 激光器作为激发源。激光束穿过中性密度 (ND) 滤光片，并通过 500 nm 二向色长通镜 (DLP) 耦合到近红外校正物镜 (OBJ)。通过在激发路径中插入透镜 (L1)，样品 (S) 上的照明点放大至约 94 µm。为了将物镜从样品收集的发光发射引导至 NIR 路径进行检测，插入了金镜 (GM)。移除镜子将发射引导至 VIS 路径。

在 NIR 路径中，信号通过NIR 长通和短通滤波器的组合(F);过滤器的组合取决于具体的实验。然后，信号通过消色差透镜(L2，f = 20 cm)聚焦到Princeton Instruments 的Acton SpectraPro ® 2500i 成像光谱仪的入口狭缝上。该光谱仪与同样来自 Princeton Instruments 的NIRvana:640 InGaAs 相机耦合(见图 2)。为了减少暗电荷，相机的近红外敏感二维焦平面阵列 (FPA) 被冷却至 -80°C。

图 2：实验装置的 NIR 路径包括与 SpectraPro 2500i 成像光谱仪耦合的 Princeton Instruments NIRvana:640 二维 InGaAs 探测器。照片由查尔斯大学 Marek Scholz 博士提供

2500i 光谱仪配置有用于光谱的光栅(150 g/mm，1.2 µm 闪耀)或用于成像的镜子。为了最大限度地减少样品光漂白，激发路径中的快门 (SH) 由 NIRvana 相机控制，并且仅在曝光时间内打开。在成像模式下，样品上 0.34 x 0.34 µm 的区域被放大至 NIRvana FPA 的 20 x 20 µm 像素大小，相当于 58 倍放大倍数。1275 nm ( 1O2磷光带)，根据瑞利准则，由衍射极限引起的空间分辨率约为 1.4 µm，由物镜数值孔径 0.55 确定。在光谱模式下，系统的光谱分辨率由光谱仪入口狭缝的宽度决定，为10 nm。

或者，在 VIS 路径中，Princeton Instruments 的 Spec-10:400B 背照式 CCD 相机与 Acton SpectraPro 2300i 成像光谱仪耦合。最近，为了同时检测 VIS 和 NIR 光谱区域，通过用短通二向色镜 (DM) 替换金镜来修改设置。原来的过滤器组也进行了修改。参见 Scholz 等人。2014 年有关实验设置的更多详细信息。

结果与结论

光谱成像方法的引入提供了一种强大的新工具，用于区分和分离1O2磷光与光敏剂的近红外扩展发光的潜在光谱重叠。它可以应用于任何表现出近红外发光的 PS。部分数据如下：更多内容可参见 Scholz 等人。2014年图 3A 中显示的图像是在连续照射细胞时捕获的，该细胞与 D2O 盐溶液中的 100 μM TMPyP 一起孵育 5 小时，激光功率为 1 W/cm2。>1250 nm 图像(使用 850 和 1250 nm 长通滤光片的组合)是通过将一系列 10 个连续帧(每帧曝光时间为 5 秒)中的最后四帧(即总共 20 秒曝光)相加而获得的。随后，曝光 25 秒获得光谱图像。随后拍摄明场和荧光图像。光谱显示1O2磷光是主要的光谱特征。对于不同的细胞，经验证，当使用1350 nm长通滤光片代替1250 nm长通滤光片时，>1250 nm图像强度下降了70%以上。

图 3：3T3 小鼠成纤维细胞与 100 μM TMPyP 在 D2 O 盐溶液中孵育 5 小时，基于 NIR 发光的图像和光谱，以及基于明场和 VIS 荧光的图像。框架 A 和 B 代表两个不同的样本。绿色矩形由光谱仪的入口狭缝定义，代表收集光谱图像的区域。光谱图是通过光谱图像的垂直合并获得的。应用单位半径的高斯模糊滤波器来平滑光谱图像，以使弱光谱特征更容易区分。

DOI：10.1039/c4pp00121d – 经英国皇家化学学会 (RSC) 代表欧洲光生物学会、欧洲光化学协会和 RSC 许可复制。

图 3B 中显示的图像是使用相同程序从孵育的不同细胞中捕获的。通过用2.5W/cm 2激光功率照射这些细胞来拍摄四张近红外图像。首先，使用 850 nm 长通滤光片和 1100 nm 短通滤光片的组合，通过 1 秒曝光获得850–1100 nm 图像 (I 1 )。接下来，使用 5 秒曝光拍摄>1250 nm 图像 (I 2 )。随后，在添加 10 等分试样后，获得曝光 1 秒的“850–1100 nm + NaN 3 ”图像 (I 3 ) 和曝光 5 秒的“>1250 nm + NaN 3 ”图像 (I 4 )。毫米NaN 3加入样品，轻轻搅拌，然后在黑暗中放置 5 分钟。观察到 850-1100 nm 信号略有下降，这可能表明存在一定程度的光漂白。然而，在 >1250 nm 图像 (I 4 ) 中，添加 NaN 3后观察到信号大幅下降。假设I 4图像中的1O2信号几乎完全猝灭，其主要由TMPyP的NIR背景发光形成。这四个图像 I 1 –I 1的组合使研究人员能够重建1O2发光的真实图像。

这种新的实验装置采用近红外敏感的二维 InGaAs 焦平面阵列作为检测器，已证明足够灵敏，可以产生与 TMPyP 孵育的单个D2O处理的成纤维细胞的1O2图像和光谱图像。该装置1O2磷光检测的总体效率估计为 1–3%。主要限制因素被确定为物镜的数值孔径(NA = 0.55)。使能技术据 Scholz 博士介绍，NIRvana:640 相机(见图 4)相对于以前使用的 1D InGaAs 探测器的主要优势在于 NIRvana 探测阵列的二维性，这使得采集时间大幅减少，并避免了一些样品光漂白引起的问题。

图 4：Princeton Instruments NIRvana:640 相机具有二维 InGaAs 检测阵列，可热电冷却至 -85°C

NIRvana:640 是普林斯顿仪器公司专门为需要卓越线性度和卓越近红外灵敏度的科学研究应用而设计的。其 640 x 512 InGaAs 检测阵列可提供 0.9 µm 至 1.7 µm 的响应，可热电冷却至 –85°C，以最大程度地减少热产生的噪声并提高信噪比。为了量化其新显微光谱装置的性能参数，布拉格小组进行了一项实验来确定 NIRvana:640(-80°C)的暗噪声。结果如图 5 所示。

图 5：每帧不同曝光时间的每像素暗计数和标准差(NIRvana640 相机)。

DOI：10.1039/c4pp00121d – 经英国皇家化学学会 (RSC) 代表欧洲光生物学会、欧洲光化学协会和 RSC 许可复制。

NIRvana:640 InGaAs 相机还提供16 位数字化和低读取噪声，实现出色的动态范围。此外，最新的 Princeton Instruments LightField® 64 位数据采集软件(作为选件提供)可通过极其直观的用户界面完全控制所有 NIRvana 硬件功能。LightField 提供自动缺陷校正、精确曝光控制以及一系列创新功能，可轻松捕获和导出成像和光谱数据。

概括

单线态氧是分子氧的第一激发态，是一种高活性物质，在多种生物过程中发挥着重要作用，包括细胞信号传导、免疫反应、大分子降解和光动力治疗过程中肿瘤组织的消除。

通常，采用光敏过程从基态氧产生单线态氧。布拉格查尔斯大学开发和使用的创新实验装置现在允许研究人员对单线态氧进行直接、实时成像，同时解决与光敏剂发出的光潜在光谱重叠的问题。这种快速数据采集显微光谱装置依赖于 Princeton Instruments NIRvana:640 InGaAs 探测器的二维阵列和卓越的近红外灵敏度。

审核编辑 黄宇