用于砷污染分析的高灵敏全细胞比色传感器开发

砷污染是全球性的健康问题，全世界大约有1.4亿人口的饮用水不能满足WHO规定的饮用水安全限（10 ppb）。长期饮用砷含量超标的饮用水将引起一系列的健康问题，甚至癌症病变。因此，美国的有毒物质和疾病登记署（ATSDR）多年来一直将砷排在危险物质名单的前列。为准确评估砷污染水平，使人类免受高砷环境的毒害，亟需开发高灵敏、快速，可靠的方法用于砷污染分析。

相比传统的高端分析方法用于砷检测，全细胞生物传感器（Whole-CellBiosensor）由于具有低花费、便携、环境友好等优势而受到青睐。然而基于天然砷调控系统（ArsR/Pars）的全细胞生物传感器通常存在高泄露表达、低诱导倍数等问题，导致传感器的背景噪音和信噪比不能满足应用需求。这主要是由于ArsR转录因子不能严格控制Pars启动子的转录。诱导-转录调控作为砷传感系统的唯一控制器，选择严谨调控的Pars启动子对于开发高灵敏的全细胞砷传感器至关重要。尽管之前的研究通过启动子工程，信号放大和翻译后调控等策略可以有效改善传感器的信噪比。

然而，那均需要额外添加ArsR结合位点（ABS）来降低传感器的泄露，其结果也表明ABS的添加不利于传感器的信号输出和灵敏度。因而需要对砷调控启动子Pars进行从头设计，然而，由于其ABS长达33 bp很难通过传统的方法将其自由的嵌入启动子不同位置。

近日，石河子大学叶邦策教授和浙江大学王宝俊教授作为共同通讯作者（石河子大学博士生陈升言为第一作者）在Analytical Chemistry杂志合作发表了题为“De Novo Design of the ArsR Regulated Pars Promoter Enables a Highly Sensitive Whole-Cell Biosensor for Arsenic Contamination”的文章。



图1 高灵敏荧光传感器的开发及比色传感阵列的快速分析

该研究将来源于Escherichia coliMG1655的砷响应系统（ArsR/Pars）作为感应元件，并分别耦合gfp和lacZ为报告基因用于重构启动子的表征。为了能有效的降低传感器的泄露表达并不损失传感器的信号输出和灵敏度，该研究将长达33bp的ABS序列与RNA聚合酶结合位点（即-10和-35位点）序列库进行比对，挖掘了ABS序列内潜在的RNA聚合酶结合位点。通过分析、设计和优化，获得了不同结构的启动子模型。并通过将ABS序列最大程度的嵌入启动子核心区（即-10和-35位点之间，约17 bp），获得了最大抑制效率和最高诱导倍数的新启动子ParsOC2，实现了泄露表达和信号输出的同时改善。基于该启动子开发的荧光传感器PlacV-ParsOC2在高于9.38 pp砷浓度时，展现出裸眼可见的绿色荧光；在300 ppb砷浓度时，诱导倍数提高至183.52倍；检测限低至0.24 ppb，比WHO规定的饮用水安全水平10 ppb低了41.67倍。



图2 不同砷响应启动子构成的荧光传感器的表征

为了快速诊断砷浓度是否超过安全水平限值，该研究使用lacZ取代了gfp作为报告基因（其产物β-半乳糖苷酶能催化无色底物X-Gal显蓝色）以产生肉眼可区分的信号输出。并验证了重构的启动子ParsOC2相比野生型启动子ParsOWT拥有更低的背景和更灵敏的颜色反应。最优的比色传感器PlacV-ParsOC2-lacZ在0-5 ppb范围内呈良好的线性，R²= 0.9928；检测限低至0.39 ppb，比WHO规定的饮用水安全水平10 ppb低了25.64倍。

基于最优的比色传感器制备了比色传感阵列，并将其耦合智能手机来实现便携设备对地下水砷样品的快速分析。通过智能手机拍照对不同稀释因子下的地下水砷样品的颜色反应结果进行快速记录，并通过颜色识别软件，对比色阵列中的每一个颜色结果进行分析，以实现对砷污染状况的快速评估。最终，该传感器的评估结果与样品的实际浓度保持良好的一致性，回收率在86.08-94.26%之间。



图3 比色法耦合智能手机分析用于砷的测定

综上所述，为解决砷响应全细胞传感器的高泄露和低诱导倍数等问题，针对带有长足迹位点的转录因子调控的启动子，该研究提出了新的启动子从头设计方法。相比易错PCR和高通量筛选等方法，该方法简便有效；同时不需要额外的遗传组分即可降低泄露和增加信号输出，为其它启动子的从头设计和传感器的开发提供了重要参考。该方法通过改变启动子的结构配置，从根本上提高了ArsR对Pars启动子的阻遏效率，避免了通过使用过量的ArsR和额外添加ABS来降低传感器的泄露。因此，该方法可以在有效降低泄露表达和增加诱导倍数的同时，而不影响传感器的灵敏度和信号输出。该研究通过耦合智能手机实现比色结果的快速分析，将促进全细胞传感器的现场应用及砷污染的快速评估。

论文链接：

https://doi.org/10.1021/acs.analchem.2c00055

审核编辑：刘清