多光子成像技术原理及优势分析

多光子成像技术是一种光学成像技术，其核心在于利用光子在样品内产生的非线性光学效应，实现高分辨率的三维成像。

在多光子激发成像过程中，激光光束作用于样品，通过双光子或多光子吸收，产生非共振荧光或次谐波。这种非线性光学效应使得多光子显微镜具有比传统显微镜更高的空间分辨率和深度分辨率。

在实际应用中，多光子显微镜在生物学、医学、纳米科学、材料科学等许多领域都有广泛的应用。例如，它可以用于对生命科学领域的细胞和生物分子进行研究，通过组织的深度成像、减少细胞萎缩等优点，极大地促进了医学、生物学等学科的发展。

多光子成像技术原理及特点

多光子激发是指在具有高光子密度的入射光激发下，处于基态的分子/原子同时吸收多个光子后跃迁到激发态，经过弛豫过程跃迁到亚稳态，最后自发辐射回到基态，释放出频率略小于多倍入射光频率的荧光光子。

图一 2PEF、3PEF过程能级示意图

由于整个过程中存在非辐射的能量损失，激光光子的能量总是会大于激发光光子的能量，也就荧光的波长会小于激光的波长。在双光子吸收过程中，荧光分子吸收两个能量较低（波长较长）的光子到达激发态，并在跃迁回到基态时产生荧光，可用于荧光成像。

但也不是任意两个光子就可以激发同一个荧光分子的，荧光分子在吸收了第一个激发光子后，等待吸收第二个光子的中间态只能维持几十飞秒，这要求激发光束中相邻两个光子的间隔必须小到几十飞秒内才能确保发生双光子荧光激发现象产生，通过双光子吸收截面公式δ=hνβ/（NAd0×10-3 ），可以得到一个大概值，也就是100GM（10-50cm-s/photon）。

相较于单光子激发荧光、激光扫描共聚焦和宽场成像等技术，多光子成像技术具有以下优点：

01多光子成像技术通常采用的激发光为波长较长的近红外光，相比可见光，近红外光在生物组织中的穿透能力更强，能够观察到生物组织中更深层的信息，侵入性较低；

02多光子成像只有在激发光焦点附近的区域才能激发荧光（如图二），因此多光子成像技术具有天然的光学层析能力，能更好地对生物组织进行三成像；

03多光子成像在样品的非焦点区域不产生荧光，能自动抑制离焦信号，因而相比宽场成像技术，多光子成像能实现近乎衍射极限的空间分辨率，因此能观察到组织内更细微的结构；

04与共聚焦成像技术相比，多光子成像技术不需要使用针孔滤波，荧光收集效率高。

此外，多焦点多光子显微技术（MMM）相较于单点扫描多光子显微技术，具有更高的光能利用率和成像速度。它利用多个激发光点并行激发样品并同时探测荧光信号，实现样品的三维快速多光子激发荧光显微成像。这种技术具有对活体样品损伤小、成像深度大、图像信噪比高等优点，因此成为在分子和细胞水平上进行生物医学研究的重要手段。

审核编辑：黄飞