单光子雪崩探测器SPAD助力激光扫描显微镜发展

据麦姆斯咨询介绍，单光子雪崩探测器（SPAD）是指工作电压高于击穿电压的APD，也称为盖革模式APD，通过配套淬灭电路和读出电路对雪崩倍增过程进行淬灭和恢复控制从而实现单光子探测。由于快速、紧凑的SPAD阵列探测器的引入，激光扫描显微镜领域正在经历快速发展。

SPAD探测器因其卓越的可靠性、稳健性、易于使用和高探测效率而在显微镜应用领域中获得了青睐。异步读出SPAD阵列探测器经过优化，可以显著增强荧光激光扫描显微镜（LSM）的能力。这些专用探测器提供独特的单光子时空信息，为温和、定量的超分辨率成像开辟了新的可能性。

SPAD阵列需要搭配读出电路（ROIC）使用，以实现雪崩信号的提取和处理，同时根据应用需求来选用光子计数、光子计时等功能电路。将SPAD和电子器件集成在同一颗芯片上使得SPAD阵列探测器能够加速发展。人们提出了各种设计策略来满足特定应用的要求。

512 x 512像素SPAD阵列探测器

初始阶段涉及一个简单的SPAD像素阵列，每个像素都包含SPAD及其前端电路。后续阶段涉及将处理电路集成到像素中以执行特定功能，从而促进每个SPAD像素的并行和独立工作。在每个像素内合并多个SPAD及其前端电路也可以抵消固有SPAD死区时间的影响并增强光子数分辨率。

荧光成像是材料分析的有效工具，特别是在生物应用中，其中许多生物分子在照射时会显示出自发荧光。与传统的荧光成像相比，荧光寿命成像显微镜（FLIM）采用时间分辨检测系统来捕获特征荧光寿命，而不是仅仅关注发射光的强度或光谱。

在扫描显微镜领域，实现必要时间分辨率的最稳健和最有效的方法之一是使用SPAD。

在Optics Express期刊上发表的“Handheld wide-field fluorescence lifetime imaging system based on a distally mounted SPAD array”论文中，研究人员展示了一种手持式荧光寿命成像显微镜系统，采用远端安装的“Endocam”SPAD阵列探测器，占用面积不到2平方毫米，分辨率为128 × 120像素，通过长度超过1米的有线接口运行。对于基准测量，研究人员通过市售的Horiba FLIMera时间相关单光子计数（TCSPC）相机来获取准确的荧光寿命信息。

手持式荧光寿命成像显微镜模块及系统

研究人员展示了使用手持式荧光寿命成像显微镜系统拍摄的绵羊肾脏的清晰图像。该图像聚焦于羊肾样本中不同组织成分区域。在荧光强度图像中，没有迹象表明该区域的组织在成分上与器官的其它部分不同。在FLIM图像中，则表现出显著的对比度，荧光寿命范围从大约1.2 ns到大约2 ns。荧光强度水平非常相似的区域在荧光寿命上表现出明显的差异。

“Endocam”SPAD阵列探测器能够以超过1 Hz的频率提供FLIM图像，同时在距控制板约1米的距离处工作，这是一项重大的成就，标志着SPAD阵列探测器首次以这种方式运行，证实了便携式成像系统可以有效地用于生物工程和其它领域。

根据Optics Express期刊上发表的“Challenges and prospects for multi-chip microlens imprints on front-side illuminated SPAD imagers”论文显示，大多数前照式（FSI）SPAD阵列探测器仍然表现出相对较低的填充因子——通常低于50%。这种限制导致光子探测效率（PDE）受到影响。

在光子有限的情况下，特别是在生物光子学中，这可能会带来挑战。一些研究采用了独特的光学系统，其中SPAD探测器充当特殊类型的共聚焦针孔，使光线能够直接聚焦在感光区域上。然而，此类设置是例外而不是常态，并且通常涉及开发和维护具有挑战性的设计。

荧光寿命成像（FLI）是一种基于从激发态到基态的衰变时间来表征分子的成像技术。时间相关单光子计数（TCSPC）由于其在时间分辨率、动态范围和鲁棒性方面优于其它技术，在荧光寿命成像系统中越来越受欢迎。在过去的十年里，SPAD阵列探测器已经成功地应用于TCSPC系统中。然而，当前的荧光寿命成像系统在处理速度和精度方面仍具有局限性。

神经网络为快速提取荧光寿命提供了一种新的途径。在Scientific Reports期刊上发表的“Coupling a recurrent neural network to SPAD TCSPC systems for real-time fluorescence lifetime imaging”论文中，科研人员将递归神经网络（RNN）集成到SPAD-TCSPC系统中，用于实时荧光寿命成像。

与依赖直方图作为输入的传统深度学习方法不同，上述开创性研究仅在数据采集后即可用，RNN消除了直方图，并以事件驱动的方式处理原始时间戳。这种方法有助于对每个入射光子的寿命估计进行增量和连续更新，从而实现荧光寿命的实时或即时采集后读数。这种创新的方法消除了存储或传输时间戳数据或直方图的需要，显著减轻了硬件内存和数据传输要求的负担。

荧光共聚焦激光扫描显微镜是生命科学研究中应用最广泛的工具之一。SPAD阵列探测器的出现预计将进一步推动激光扫描显微镜的日益普及。与传统的激光扫描显微镜单点探测器相比，SPAD阵列探测器保留了入射荧光光子的空间分布。与科学相机不同，每个阵列像素都作为一个完全独立的SPAD运行，确保了高的时间精度。将现代数据采集（DAQ）系统与SPAD阵列探测器集成，可以实现高效、快速的光子分辨发射测量。

近期在Advanced Photonics期刊上发表的“Compact and effective photon-resolved image scanning microscope”论文中，研究人员成功地将一种新的基于数字频域（DFD）的DAQ和控制系统集成到单光子激光扫描显微镜（SP-LSM）中，并结合了商用的SPAD阵列探测器。该技术利用超分辨率显微镜（FLISM）实现了荧光寿命成像。

研究人员使用自适应像素重新分配（APR）从原始数据中重建超分辨率图像。与传统的共聚焦激光扫描显微镜相比，超分辨率显微镜显示出优越的性能，在捕获的图像中显示出更好的分辨率。

上述论文中的研究表明，激光扫描显微镜的未来与SPAD阵列探测器之间有着密切的联系。将SPAD阵列探测器与定制采集系统集成，简化了对光子分辨成像光谱显微镜的数据访问和使用。

审核编辑：刘清