使用拉曼光谱检测组织的恶性变化

介绍

准确、快速、无创地检测和诊断组织中的恶性疾病是生物医学研究的重要目标。漫反射、荧光光谱和拉曼光谱等光学方法都已被研究作为实现这一目标的方法。漫反射利用组织的吸收和散射特性，特别是细胞核和基质的吸收和散射特性。由于血红蛋白含量的变化3和新血管形成4，组织变得更加发育不良，组织的散射特性发生变化。荧光光谱也受到组织光学特性变化的影响，并已用于诊断发育不良。然而，这些技术存在许多缺点，包括需要大量样品制备或切除，以及灵敏度和特异性较低。

许多研究小组转而使用拉曼光谱来检测和诊断 体内疾病，而无需去除组织或添加外源性试剂。拉曼光谱是一种基于拉曼散射的方法，是一种强大的技术，可应用于许多组织部位。拉曼光谱是一种分子特异性技术，可探测化学键中的振动或旋转跃迁，并提供有关样品生化成分的详细信息。该技术的灵敏度非常高，以至于拉曼光谱实际上是组织生化组成的精确指纹。

我们开发了一种基于探针的拉曼光谱系统，可以在体内非侵入性地获取拉曼光谱，用于我们的研究。我们小组的总体目标是使用拉曼光谱成功检测和诊断异常组织，无论患者的年龄、种族、体重指数 (BMI) 或病史如何。已经建立了几乎相同的系统来获取拉曼数据以研究各种恶性肿瘤，例如宫颈发育不良、宫颈早产的变化、皮肤癌、结肠癌和乳腺肿瘤边缘。采集后，拉曼光谱经过校准以考虑日常变化，并进行处理以减去背景荧光和平滑的噪音。最后，进行统计分析以确定拉曼光谱是否能够诊断恶性区域。

装置和方法

图 1 显示了一个实验装置的原理图和图片。它由连接到 785 nm 二极管激光器(来自 Process Instruments, Inc. 或 Innovative Photonics Solutions)的 EMVision 光纤探头、Kaiser Optical Systems 成像光谱仪(Holospec)组成。 ，f/1.8i-NIR)和背照式、深耗尽、热电冷却的 Princeton Instruments CCD 相机(PIXIS 256BR)。这些系统均由笔记本电脑使用 Princeton Instruments (Winspec) 提供的软件进行控制。在大多数实验方案中，光纤探头将80 至 100 mW 的光传送到组织上，积分时间为2-5 秒。测量期间，所有房间灯光和计算机显示器均关闭。实现了8个波数(cm -1 )的光谱分辨率。

对于这些研究，我们开发了 7-around-1 光纤探头。激发光纤直径为 400 μm，每根收集光纤直径为 300 μm。以下是获取拉曼数据的典型协议。首先，用干棉签清洁审讯区域，然后用盐水清洁。关闭灯后，将拉曼探头放置在该区域上并进行测量。当所有测量完成后，将探头擦干净，放入10% 漂白剂溶液中至少 10 分钟，然后放入去离子水中5-10 分钟。

一般来说，获取拉曼光谱的方案是由研究目标决定的。对于我们的宫颈发育不良研究，数据是从两组患者群体中获取的：1)来诊所进行筛查的大部分正常人群;2)来诊所进行疾病诊断的患病人群。在第一组患者中，清洁子宫颈，然后从子宫颈的三个区域获取拉曼光谱。光谱与所得病理报告相关，病理报告可以是正常细胞、非典型细胞、低度不典型增生或高度不典型增生。在第二组患者中，患者已经接受过筛查用于宫颈不典型增生，并且具有非典型细胞、低度或高度不典型增生。

图 1： a) 体内拉曼光谱设置图示，包括二极管激光器、探针(带有探针前列的详细信息)、光谱仪和 CCD 相机。 b) 推车上的系统照片，可供诊所使用。注意指向探头的黄色箭头。

在此检查期间，将醋酸放置在子宫颈上，使任何异常区域变白。然后从医疗提供者决定活检的任何区域以及一个视觉正常区域获取拉曼光谱。然后进行活检。该手术的病理结果为阴性、炎症/化生、宫颈上皮内瘤变 I-III 级 (CIN I-III) 或原位癌 (CIS)。

然后对拉曼数据进行校准和处理，以减去背景荧光并平滑噪声。这些方法已在前面描述过。在宫颈不典型增生检测中，稀疏多项逻辑回归 (SMLR)用于将每位患者的光谱分类为正常、良性、低级别 (CIN I) 或高级别 (CIN II 或 III)。简而言之，SMLR 是一个贝叶斯机器学习框架，它根据标记的训练集计算属于每个组织类别的频谱的后验概率。第 1 组使用对每位患者的拉曼测量进行平均的复合光谱。对于第二组，使用每个单独的光谱，因为它们是从可以与特定病理报告相匹配的不同位点获得的。

结果与讨论

使用拉曼光谱检测宫颈发育不良一直是我们实验室正在进行的研究。在我们最初的研究中，光谱是从因良性或恶性疾病而接受全子宫切除术的患者的子宫颈获取的。在这些研究中，拉曼光谱被分类为正常、良性或恶性，敏感性为89%，特异性为81%。尽管这些结果与使用标准临床技术时发现的结果相似，但它们没有提供足够的证据证明拉曼光谱可以成功诊断宫颈发育不良并易于在临床中实施。

最近，我们一直在收集上述设置和方法部分中所述的数据，这导致了对500 多名患者的测量。在第一组研究中，从两个患者组获取光谱并进行分类，准确率超过 88%。虽然这些结果仍然不适用于临床，但用于对数据进行分类的方法 (SMLR) 显示正常数据之间存在很大差异。

进一步的研究集中在寻找这种差异的来源并检查它们是否影响疾病谱的分类。例如，我们之前的工作表明，差异可能是由于正常月经周期和绝经前后荷尔蒙水平的变化造成的。 此外，疾病的存在会永久改变子宫颈，从而改变从子宫颈获取的拉曼光谱(图 2)。在疾病分类之前将这些结果纳入 SMLR 算法，将每项研究的分类准确度提高到94%和97%。

图 2：宫颈不同区域的平均归一化拉曼光谱。

目前，我们正在研究可能由种族、胎次、社会经济地位和体重指数引起的差异。我们的初步结果表明，奇偶性，即比较已生育过的女性和从未怀孕过的女性的拉曼测量值，以及体重指数的变化对正常拉曼光谱的色散有显着影响(正在出版)。正在进行研究，看看考虑到这些变化是否也会导致疾病分类率增加，类似于激素状态和既往疾病的结果。

由于我们的系统中使用的技术日益复杂，这些细微的变化仅被观察、解释并纳入疾病分类算法中，以提高敏感性和特异性。具体来说，光纤探头和CCD 相机是不可替代的组件，它们极大地提高了系统的分辨率，使我们能够检测到由于正常患者变化而引起的微小变化。考虑到这些变化使算法能够专注于检测疾病引起的变化，从而提高疾病分类率。

未来的方向

虽然本说明的重点是使用拉曼光谱来检测宫颈发育不良，但我们的研究小组和其他人也利用拉曼光谱来检测其他组织部位的恶性肿瘤，例如乳房、皮肤、结肠和前列腺。此外，拉曼还被探索作为一种检测内分泌腺、临产迹象的子宫颈变化和炎症性肠病的方法。如上所述，光纤探头可以单独使用，也可以插入内窥镜等临床工具中，以收集拉曼数据。

拉曼光谱还有许多不同于传统光纤探头的用途。空间偏移拉曼光谱 (SORS)已被开发出来，通过分离探针内的纤维来探查更深层的组织。 SORS 已用于骨骼应用和评估肿瘤边缘。表面增强拉曼光谱 (SERS)依赖于添加金属表面后拉曼信号的增加，例如将金纳米颗粒应用于样品后。该技术已开发用于体内使用以及拉曼显微镜。最后，拉曼显微镜提供了更高的分辨率比基于探针的系统可以实现的目标。这些系统中的大多数不能用于体内诊断，但是目前正在进行将显微镜的分辨率与拉曼的准确性相结合的方法的研究，例如共焦拉曼光谱。

拉曼光谱有潜力帮助解决医学界面临的许多问题。使用优化的设备对于最大限度地成功应用该技术进行疾病诊断至关重要。我们相信，随着技术的不断进步，医疗服务提供者将从传统技术转向拉曼光谱等光学方法，以提供快速、准确、非侵入性的诊断。

审核编辑 黄宇