利用微型SPAD系统实现荧光寿命成像+ToF测距

据麦姆斯咨询介绍，硅单光子雪崩二极管(SPAD)阵列具有优异的灵敏度和较低的暗计数率。重要的是，用于时间门控、时间相关单光子计数(TCSPC)和一些数据处理的电子器件可在像素级集成。这使得SPAD特别适合诸如荧光寿命显微成像(FLIM)和宽视场荧光寿命成像(WFLIm)等应用。WFLIm是一种成像模式，在该模式下，以足够精细的时间分辨率捕获宏观尺度物体的荧光衰减，从而可以计算荧光寿命。这可以提供仅通过荧光强度无法获得的额外对比度，突出材料性质或组成的变化。

时间门控SPAD阵列的另一个常见应用是飞行时间(ToF)测距，例如激光雷达(LiDAR)，其中时间分辨率用于测量从物体散射的光子的往返时间，从而计算出距离。最近，下文中的研究团队已经展示了可从相同的时间分辨SPAD数据中同时提取WFLIm和ToF数据，以实现荧光物体的3D场景重建和表面映射(DOI: 10.1117/12.2648431和DOI: 10.1117/12.2648431)。这与之前大多数将ToF和WFLIm结合的尝试不同，因为这些尝试往往侧重于定位样品深处的外源荧光夹杂物，尽管荧光ToF/LiDAR是一种成熟的技术，但它往往只关注荧光强度，而不是荧光寿命。这种复合技术，在下文中将被称之为FLImDAR(具有ToF测距功能的荧光寿命成像)，在内窥镜检查、手术指导和诊断成像等生物医学领域具有明确的应用前景。除了在生物医学成像中的应用外，这种WFLIm与ToF信息的结合还可用于勘测和农学等领域，在这些领域，荧光寿命可提供有关植物健康和病理学的信息，或在核反应堆等危险区域进行遥感。然而，迄今为止，FLImDAR仅使用基于TCSPC的系统。这些系统是具有许多数据输入/输出(I/O)的大型台式系统，以满足TCSPC所需的高带宽数据传输。

据麦姆斯咨询报道，近日，英国爱丁堡大学(University of Edinburgh)和赫瑞-瓦特大学(Heriot-Watt University)的研究人员组成的团队展示了一种基于时间门控SPAD阵列(以“尖端芯片”的方式运行)的微型成像系统。研究团队展示了具有不同的视场和工作距离的成像系统的两个版本(系统A和系统B)，每个版本的尺寸均为23 mm × 23 mm × 28 mm。初步测试展示了在宽视场荧光成像(WFLIm)模式下不同材料之间的对比度，帧率可达到 > 2 Hz。随后，以~1 Hz的帧率获得了绵羊肺组织中自发荧光的WFLIm图像。最后，研究人员还测试了第二个系统同时执行WFLIm和ToF(即FLImDAR)的能力。结果表明，当在3D打印的样品上进行测试时，该系统能够实现4 mm分辨率的物体区分。此外，该系统还能够对自发荧光的肺组织进行场景重建。该系统是迄今为止已报道的最小的尖端芯片WFLIm系统，也是FLImDAR技术在紧凑型便携式系统中的首次演示。上述研究成果以“Fluorescence lifetime imaging with distance and ranging using a miniaturised SPAD system”为题发表于Scientific Reports期刊。

Endocam传感器(由120 × 128 SPAD像素构成，每个像素都有自己的集成光子计数电子元件)被设计用于成像系统的远端，并且可以在约1米的有线接口上运行。然后它可以集成到一个小型光学系统中，如图1a所示。该SPAD成像系统的示意图如图1b所示。为了制造本研究提出的微型系统，外壳采用聚乳酸(PLA)3D打印，外部尺寸为23 mm × 23 mm × 28 mm。激发光由滨松(Hamamatsu)Picosecond Light Pulser PLP-10激光二极管头提供，波长为483 nm，脉冲宽度为80 ps，耦合到多模光纤(数值孔径NA = 0.5，Thorlabs M124L02)中，在20 MHz频率下提供~ 0.3 mW功率。发射的荧光(图1b中的橙色箭头)穿过光圈和二向色镜，并被第二个二向色镜(Thorlabs DMLP550R)进一步过滤，以清除外壳内散射的任何杂散激发光。然后它通过一个低成本塑料非球面透镜(焦距为3.32 mm，数值孔径为0.4，Thorlabs CAY033)聚焦，并在Endocam传感器上形成图像。

图1 微型SPAD成像系统及测试样品

图1c所示为3D打印的荧光测试样品，绵羊肺组织样品如图1d所示。为了避免背景光的影响，所有测试都是在暗室中进行的，这与在体内使用内窥镜系统的条件相同。

对系统A的初始测试是使用门控-扫描模式在3D打印样品上进行的，如图2所示。在图2a所示的荧光强度图中，字母U和E(代表爱丁堡大学)都清晰可见，但图2b所示的强度图像直方图显示这些材料之间的区分不明显。图2c所示的WFLIm图像显示出更好的对比度，如图2d所示图像直方图所示，存在两个明确的峰值。

图2 3D打印荧光样品的测试结果(系统A)

图3a和图3b分别显示的是绵羊肺自发荧光的强度图像和寿命图像。为了改善这些寿命图像的信噪比(SNR)，在进行寿命计算之前，对这些图像进行了2倍的空间下采样。这导致图像稍微像素化，但如图4b所示，使用WFLIm模式时，图像中左右两侧对象寿命的对比度更加明显，而仅在强度图像中未能显现这一点。

图3 绵羊肺组织的荧光强度和寿命成像(系统B)

如前所述，该研究团队最近已经展示了时间分辨SPAD传感器可用于执行WFLIm和ToF测距的结合，以便同时进行荧光寿命对比度和3D场景重建。在图4中，该团队使用微型Endocam传感器系统展示了这种能力，这是首次以这种方式使用手持式移动传感器展示这种模式，也是首次对时间门控单光子计数而不是TCSPC数据进行FLImDAR分析。

图4 3D打印样品的FLImDAR 3D点云(系统B)

图4a显示了放置在距离传感器相同距离处的两个3D打印样品的距离图像，图4b则是“E”的位置比“U”的位置近80 mm的结果。将WFLIm和距离信息结合起来，可生成图4d所示的3D点云，其中Z轴表示距离，点的颜色表示荧光寿命，这是首次从FLImDAR数据中生成此类可视化图像。

最后，研究人员将FLImDAR和尖端芯片成像结合并应用于组织自发荧光，以生成图5所示的绵羊肺组织的3D点云。

图5 绵羊肺组织的FLImDAR 3D点云(系统B)

综上所述，这项研究演示了微型时间分辨成像传感器的使用，这种传感器足够小，可用于一些体内应用，并且能够利用接近每秒1帧的自发荧光的荧光寿命来提供绵羊肺中不同组织类型之间的对比度。该SPAD成像系统的研究建立在先前工作的基础上，是首个小到足以用于某些体内应用的尖端芯片WFLIm系统。此外，这是通过小型手持系统部署的新型FLImDAR模式的首次演示。尽管采集时间较慢，但该系统在对明亮样品成像时表现出的~4 mm空间分辨率，以及同时从绵羊肺自身荧光获得距离和寿命的能力表明，FLImDAR可能是微型内窥镜成像的一种可行模式。