北京大学发明新型三光子显微镜，实现深层活体三维脑成像的研究

北京大学信息科学技术学院、区域光纤通信网与新型光通信系统国家重点实验室王爱民副教授课题组与分子医学研究所陈良怡教授课题组合作发明了一种基于贝赛尔光束的新型三光子显微镜（Bessel-Beam three-photon microscopy）。此显微镜成功实现针对稀疏标记的样本进行快速深层活体三维脑成像的研究。利用光学成像技术在活体上观察组织和细胞内的动态过程，是研究生物医学问题的关键手段之一。三光子显微镜，对常用绿色及红色荧光蛋白的激发波长与双光子相比更长，且正好处于生物组织的最佳红外通光窗口（1.3 μm和1.7 μm），具有更好的光学穿透效果；此外，作为更高阶的非线性效应，三光子显微成像相比双光子能明显提高信号背景比。目前，三光子可以在实现组织1.7 mm深度左右的无损高分辨率成像，从而观察小鼠大脑皮层下的海马区的结构和功能。

多光子显微系统一般采用“点扫描”的方式进行成像，本身极大限制了其三维体成像速度。尤其针对三光子来说，激发脉冲的重复频率通常在2 MHz以内，若考虑20 μm厚的样本（512×像素点512像素点，2 μm 的z轴间隔），其体成像速度被限制在0.7 Hz，无法实时同步观察成百上千个神经元群中的动态信号过程。本工作使用z轴方向拉伸的贝赛尔光进行“光柱扫描”成像，针对稀疏标记生物样本的三光子三维体成像的速度可以提高10倍或更高，从而更清楚地解析大脑神经信号处理中的四维时空过程。贝赛尔光方法虽然已于双光子显微成像中得到应用，但其旁瓣效应大大降低成像质量。由于三光子激发为更高阶的非线性效应，旁瓣效应得到有效抑制， 贝赛尔光与三光子成像相结合可将两者的优势获得最大的发挥。

成像不仅仅比双光子更深，即使是同样深度的情况下也可以得到比双光子贝赛尔显微镜更高分辨率和对比度的荧光图像。研发团队在果蝇、斑马鱼及小鼠大脑上充分证实了利用这一成像技术的优势。

小鼠脑海马神经元三光子显微荧光成像，其中：图a，深度为620～680 μm神经元钙荧光活动在贝赛尔光柱模式下可被同时记录；图b，相应体积内神经元活动的高斯光成像（贝赛尔光模式、高斯光模式的成像时间分别为1 s和60 s）

近日，上述成果以《快速体成像贝赛尔光束三光子显微镜》（Rapid volumetric imaging with Bessel-Beam three-photon microscopy）为题，在线发表于《生物医学光学快报》（Biomedical Optics Express）；并列第一作者为信息学院2014级博士研究生陈冰影和分子医学所2013级博士研究生黄小帅，王爱民和陈良怡为共同通讯作者。相关工作得到国家重大科研仪器设备研制专项资助。这也是该项目组继成功研制双光子光片显微镜（高速活体）、2.2 g微型化双光子显微镜（活体可佩带）、超分辨显微镜（高分辨活体）之后，在突破活体生物成像深度方面取得的重要研究成果。