纳米孔测序技术及第四代基因测序技术的介绍

　　纳米孔测序技术（又称第四代测序技术）是最近几年兴起的新一代测序技术。目前测序长度可以达到 150kb。这项技术开始于 90 年代，经历了三个主要的技术革新：一、单分子 DNA 从纳米孔通过；二、纳米孔上的酶对于测序分子在单核苷酸精度的控制；三、单核苷酸的测序精度控制。目前市场上广泛接受的纳米孔测序平台是 Oxford Nanopore Technologies（ONT）公司的 MinION 纳米孔测序仪。它的特点是单分子测序，测序读长长（超过 150kb），测序速度快，测序数据实时监控，机器方便携带等。这篇综述重点总结了 MinION 测序仪的技术特点和应用领域。

　　一、 MinION 测序技术简介

　　MinION 纳米孔测序仪的核心是一个有 2，048 个纳米孔，分成 512 组，由专用集成电路控制的 flow cell。测序原理见图 1a 所示：首先，将双分子 DNA 连接 lead adaptor（蓝色），hairpin adaptor（红色）和 trailing adaptor（棕色）；当测序开始，lead adaptor 带领测序分子进入由酶控制的纳米孔，lead adaptor 后是 template read（即待测序的 DNA 分子）通过纳米孔，hairpin adaptor 的作用是 DNA 双链测序的保证，然后 complement read（待测序分子的互补链）通过纳米孔，最后是 trailing adaptor 通过。在上述测序方法中，template read 和 complement read 依次通过纳米孔，利用 pairwise alignment，它们组合成 2D read；而在另外一种测序方法中，不使用 hairpin adaptor，只测序 template read，最终形成 1D read。后一种测序方法通量更高，但是测序准确性低于 2D read。每个接头序列（adaptor）通过纳米孔引起的电流变化不同（图 1c），这种差别可以用来做碱基识别。