第2节 电子显微镜基础知识

一、分辨率
    一台光学仪器所能区分清2个点之间的最小距离，即称为该仪器的最高点分辨率：d=δ。显然，分辨率越高，即d的数值(为长度单位)愈小，则仪器所能分清被观察物体的细节也就愈多愈丰富，也就是说这台仪器的分辨能力或分辨本领越强。
    关于分辨率还有一种定义，叫做线分辨率。是指所能区分两条线之间的最小距离。线分辨率与点分辨率并不相等，通常对同一台仪器而言，它的线分辨能力总是稍强于点分辨率， 即d线＜d点，这一点是可以理解的，就象我们的眼睛区分靠得很近的线比区分两个靠得很近的点要来得容易一些。
    分辨率是标志一台光学仪器性能最重要的衡量参数，在电子显微镜说明书的技术参数栏 目里，一般都会将标志其性能水平的点分辨率和线分辨率分别给出。分辨率在某种意义上说，如同于人眼的视力一样，会受到许多因素的影响。人的眼睛会因近视、远视、散光等影响 而导致视力下降，最终的测试差别，可反映在对视力表的观察上。据测定，正常视力的人眼，其最高分辨能力约为0.2mm左右，即d人眼≈0.2mm。
在光学原理中，有一个很著名的阿贝(Abbe)公式：
式中：λ ��使用光线的波长值
      n ��光路中透镜对介质的折射率系数
      α ��入射光束与透镜光轴间的夹角
    对于普通光学显微镜，为使分辨率提高即d↓，则须使λ↓或(n·sinα)↑。选用玻璃材料透镜只能使其对介质(空气、水或油)折射率的最大值为nmAx→1.5左右。α→90°时，sinα的最大值才为1，所以（n·sinα）的最大值只能为1.5。则d≈0.5λ，即分辨率约为使用光波长的一半。
    可见光的波长范围是：390nm～760nm，取可见光的波长为较短数值λ=400nm时（相当于紫色光），dLM≈200 nm=0.2μm，这基本上可认为是一般光学显微镜的最高分辨能力了。
    从阿贝公式和以上分析可以看出，追求更高分辨率最有希望的途径则是选用波长更短的光线了。我们知道，从无线电波、可见光、X和γ射线到电子波，都具有波动性质，可以统称为电磁波，只是由于各自产生的条件不同，致使其频率和波长也不同，见表4-2。

       表4-2电磁波的波长范围

紫外光显微镜的分辨本领之所以能高于普通可见光显微镜，是由于紫外光的波长较可见光为短，对于X线、γ射线虽然波长更短，由于找不到合适的透镜材料而无法研制。
    从表4-2中可看出，如选用电子波来观察物体，其波长更短，更有利于提高分辨率。电子显微镜正是利用电子波束做为“光源”来进行放大成像的。在100kV的加速电压下可产生波长为0.00387nm的电子波束，与可见光的最短波长390nm相比较,波长降低了约100000倍。但由于电镜入射光线与光轴夹角只能取得很小：α≈10-2～10-3弧度，即 sinα≈α＝10-2～10-3。对于电镜的折射元件��磁透镜n=1，则nsinα=1 0-2～10-3。再考虑电镜的其他特定因素，电镜分辨率（dEM）大约在0.1nm左右。由于材料缺陷、加工精度、工作状态、操作技术和样品制备等多方面因素的影响 ，并非每台电镜都能轻易达到这个分辨率水平的。一台电镜的分辨率是其所能达到的最高分辨结果。制造厂家所给出的分辨率数值，是在最佳状态下，由最熟练的操作者使用特制的检验标本拍摄出来的，常规状态下操作时，观察实际标本所能达到的成像分辨率往往要低得多 。
    二、放大率
    单就放大率（magnification）而言，是指被观察物体经过光学系统放大后，在同一方向上像的长度与物体实际长度的比值。这是两条直线的比值，有人将放大率理解为像与物的面积比，这是一种误解，势必引起概念上的混淆和计算方法与结果上的混乱。
    在光学显微镜中，如果仅仅考虑放大倍数的提高，只要增加透镜级数，改变透镜的配比，几乎可以使放大倍数无限制地增大，但在实际制作和使用中可发现，尽管放大倍数可以提高到很大，分辨本领却没有提高。人们不但没有因此而看得更清晰、分辨更丰富的细节，相反，得到的影像却反而变得模糊不清。究其原因，除了光学透镜自身不能被彻底消除的各种像差等固有缺陷随着透镜级数的增加，而被愈加明显地暴露出来，导致成像质量的严重下降以外，还有一个更重要的因素，即光的衍射现像的存在。光的衍射与其波长值有关，当我们所要分辨的物体越小，衍射效果越是明显。所以尽管放大倍数可以增加很大，而实际分辨能力却被使用光线的波长等因素所限制，继续单纯地提高仪器的放大倍数是没有实际意义的，为使放大倍数具有实际意义，我们引出了一个关于放大倍数的新定义��有效放大率：
                                 M有效=d眼/d镜
    为人眼之分辨率与显微镜之分辨率的比值。对于光镜来说：
MLM=dege／dLM≈0.2 mm／0.2 μm=1000×
    对于电子显微镜：
MEM=dege／dEM≈0.2 mm／0.2 nm=1 000000×
    可见一台仪器分辨力的水平决定了自身的有效放大率。是光学显微镜将人眼的分辨能力放大了1000倍，才使我们在医学上从解剖学的水平提高到细胞学的水平。而电子显微镜则将我们的分辨能力放大了1000000倍，能使我们对形态学的研究跨入了超微结构甚至分子结构的领域。
    三、电子束的产生及特点
    众所周知，构成物质的最基本的单位是原子，原子是由原子核和核外绕核快速旋转的电 子组成。在正负电荷所构成的电场引力的作用下，原子核才与电子紧密结合在一起。以金属原子为例，当核外高速旋转的电子在受热或通过其他方式获得足够的能量，在达到某一个阈值时，便可克服原子核对它产生的电场吸引力，从原子内部飞逸出金属表面，成为自由电子。此时，如果在金属附近加上一个静电场，飞逸出来的自由电子会受到正电荷的引力作用，形成一股电子束流，向高电位方向飞射过去。电场的高电位处称为阳极，低电位处��即产生自由电子的发射源，称为阴极。阴极可以由金属板、片制成，靠旁边的灯丝加热产生自由电子(旁热式阴极),也可以由灯丝自身通电发热产生自由电子(直接式阴极)。阴极与阳极间电位差的大小，我们称为加速电压值，在加速电压的作用下，使自由电子的运动从飞逸出金属表面的杂乱状态，变为有序的定向运动。并加快到一个与加速电压相对应的速度,这个速度的不同也对应了不同的波长值，因为电子波束正是一种具有波动性质的电磁波。其波长值为：
                                     λ=h/(mv)
式中：h �� 普郎克常数为6.63×10-34J·s
      m �� 电子质量为9.1×10-31kg
      v �� 自由电子被加速所达到的速度
    在加速电压为V时，带负电荷量为e的电子，能被加速达到的运动速度v，可以从能量守恒定律的关系中得出：
                                  ev =                  
                                  v =  =5.93×105  (m／s）
    即电子运动速度v与加速电压V的平方根成正比，则
                               λ= h/(mv) = 1.226／（nm）
    电子束的波长值λ与加速电压V的平方根成反比。
    归纳起来，电子束具有以下特点：①电子束为具有一定指向和运动速度，自身带有负电荷的粒子流，电子运动速度v与加速电压V的平方根成正比；②它又是一种具有波动性质的电磁波(具有波粒二象性)，波长随加速电压值增高而缩短，电子束的波长值λ与加速电压V的平方根成反比；③作为电子束流，在穿越磁场时，会因磁力作用而偏转运动方向，即发生折射；④电子束轰击样品时，能在不同深度激发出包含不同信息的电子，照射荧光物质能使之发出荧光，轰击胶片上的感光物质则能产生光化学反应��曝光；⑤电子束虽然是电子显微镜所使用的“光源”，但由于其波长极短，所以只是一种肉眼所看不见的“光”，电镜放大的影像最终必须转化为可供人眼观察的可见光影像。
    四、电子束入射样品时所产生的各种信息
    电子束与样品原子间的相互作用是表现样品形貌和内部结构信息的唯一途径。入射电子 与样品原子中的电子和原子核会发生弹性碰撞和非弹性碰撞，所产生各种电子信号和电磁辐 射信号（图4-3）都带有样品原子的信息，从不同角度反映出了样品的表面形貌、内部结构、 所含元素成分、化学状态等。 
图4-3 入射电子轰击样品和非弹性散射电子

   图4-3入射电子轰击样品时产生的各种电子信号
    信号在样品内产生的位置、深度和范围各不相同，这一方面与入射电子束的能量和打在样品表面的束斑大小有关，另一方面也与样品内对各种信号的吸收差异有关。各种信号被特定的检测系统收集后，可形成不同的影像或其他形式的信息而被用于不同的显示目的。如透射电镜利用透射电子成像，扫描电镜则主要利用二次电子建立影像，还可以通过一些其他附加装置（波谱、能谱分析仪）接受某种特殊信号来进行信息处理。各种电子信号的产生来源及用途分别叙述如下。
    1.透射（transmitted）电子
    这是透过样品的射出电子，其能量接近于入射电子能量。透射电子的数量多少、能量大小以及散射角度均与样品的质地和厚度有关。透射电子在与光轴垂直的横截面上的密度分布 对应于样品内部的空间结构信息，透射式电子显微镜就是利用穿透样品的电子来成像的。
    2.二次（secondary）电子
    二次电子是被入射电子所激发出来的样品原子中的外层电子，它产生于样品表面以下几个nm 到几十个nm的区域内。其产生率主要取决于样品的形貌和成分的差异。二次电子是扫描式电 镜成像的主要信息载体，用于再现样品的表面形貌结构。
    3.背散射（backscattered）电子
    是指入射电子在样品中受到原子核的卢瑟福散射后被大角度反射回来的电子，它产生于样品内部约100nm的深度。采用背散射电子所形成影像的衬度主要取决于样品的原子序数。这种背散射电子衍射图可以用来研究样品的晶体学特征.
    图4-4特征Ｘ线与俄歇电子的产生 

图4-4 特征线与俄歇电子的产生

    4.特征X线（characteristic X-ray）
    样品原子中的内层电子被入射电子电离后，能发出包含元素特征的Ｘ线,它产生于500nm 左右的样品深部区域。由于样品中不同的元素可以发出不同的特征X线, 据此可以对样品进行成分分析。
    5.俄歇(Auger)电子
    样品原子中的内层电子被入射电子束激发电离后留下了空穴，此时，高能级上的电子必然要向低能级跃迁以填补空穴。电子从高能级向低能级跃迁时势必释放出能量，这种多余的能量可以以辐射的形式释放(即产生特征X线)，也可以使另一外层电子从样品表面逸出（图４-４），此种逸出的二次电子叫俄歇电子,它产生于样品表面有限的几个原子层，其能量与样品的化学成分有关，这种信号主要用于研究样品的表面特性。
    6.阴极荧光（cathodoluminescence）
    外层电子受X线激发跃迁，而后回复原状态时发出的电磁辐射，或者某些固体材料原子中的价电子被入射电子激发到高能级上所产生的弛豫发光叫阴极荧光。利用这种信号可研究发光半导体材料中的晶格缺陷等。
    五、电磁透镜
    1.电磁透镜的结构、原理和特点
    (1)电磁透镜的结构  主要是由轴对称的铜芯线圈按螺旋管状均匀绕制而成，外面包覆着密封的铁壳，内嵌导磁率极高的软铁极靴。铜芯线圈在通电后能产生轴对称的磁场，仅由铜芯线圈产生的磁场不够集中，包覆铁壳及镶嵌软铁极靴的目的，是为了使磁场强度的空间分布高度集中在电磁透镜的轴中心，从而以较小的空间尺寸获得极大的电磁折射率。图4-5（a）为电磁透镜的剖面示意图，（b）为透镜磁场的空间分布曲线，（c）为实物外形实装组合示意。
 
图4-5 电磁透镜

图4-6 电磁透镜的折射与会聚

    (2)工作原理  当铜芯线圈中有电流通过时，将产生一个以透镜轴中心呈对称分布的闭环磁场，中心磁力线密度极高，电子束流在穿越磁场时必然会切割磁力线，从而受磁场洛仑兹力的作用而发生偏转折射，并能使电子束从磁场的一端流入而在另一端被重新会聚（图4-6），类似于光学透镜中光线的会聚现象，同样起到一个透镜的作用，故称电磁透镜。调整透镜线圈中电流的大小，可以连续改变电磁透镜对电子束的折射率，因此电子显微镜能够通过透镜电流的调节，来无级变换焦点及放大率。任何一级透镜可以在需用时打开，还可以在不用时关闭（切断透镜电流即可），这与光学透镜的使用有着极大的不同。后者的镜片一经做好便固定下来，透镜总体的焦点及放大率的改变，要通过各级透镜之间的空间距离变化组合来实现。
    (3)电磁透镜的特点和类型  由于构成要求和工作原理决定了电磁透镜具有以下特点：① 结构复杂，对制作材料的纯度、元件几何形状尺寸的加工精密度等都要 求极高；②易于调整，通过改变线圈中流过电流的强度，可以改变磁场强度，达到变化折 射率和焦距的目的；③像差较小，且较为容易消除或校正；④对电子束流的能量损耗小（在光学透镜中为达到这一目的，须施以多层镀膜等繁琐工艺，付出很多代价才能实现）；⑤ 能在较短的距离内产生较大的折射率，从而有效地缩短了镜体的总长度。根据电镜总体设计各级透镜的功能要求不同，电磁透镜主要可以分为2种类型：强磁透镜和弱磁透镜，前者焦距短，折射率高；后者焦距长，折射率低。可通过应用材料结构和通过线圈的电流强度的不同来制成。透射式电子显微镜主要是通过组合透镜间的折射率变化和配比变化，来改变成像的放大率的。
 
图4-7 球差的形成和光阑的作用

    ２.电磁透镜的像差与消除
    电磁透镜中的像差类似于光镜中的像差，其产生原理一样，故描述当中常常沿用“光线”一词来喻作电子线束。电镜的像差也可以分成几类，只是所采用的相应消除措施与光镜各不相同。
    (1)球差  由于成像的远轴光线与近轴光线的光路（传播路径）不同， 致使远轴光线与近轴光线在光程（传播路途）上产生了差异，造成所形成影像的焦点位置出现了前后不同，参见图４-7（a），这一原因所引起的像差称为球面像差，又称球差。当入射光与光轴发生倾斜时也会加大透镜的球差。所以电磁透镜和光学透镜一样也常常加有透镜光阑,见图4-7（b），选用较小的孔径角，用以遮挡远轴光线，着重利用近轴光线成像，从而降 低球差带来的影响。此外加装电子枪和电子束的倾斜校正线圈；也可以有助于消除或减少球差.
    (2)衍射像差  光线遇到小孔或小障碍物时会产生绕向前进，这种衍射效应所导致的像差称为衍射像差。孔径越小，越接近光线的波长值，衍射像差就越明显。所以光阑孔径太小，虽然有利于消除球差，却使衍射像差增大，故光阑大小恰当值的选取也很重要，要视情况而定，权衡选择.
    (3)色差  如果施给自由电子的阳极加速电压值发生了变化(实际上不可能达到绝对地稳定不变)，将会引起电子束波长的变化，而同一块透镜对不同波长的电子束产生的折射率是不同的。这种现象如同光学透镜一样（图4-8），该像差同样被称为色差或色散。所以电镜须要求配以十分稳定的电压与电流恒定装置，尽可能地限制电子束波长的飘移。 

图4-8 色差现象
    (4)轴上像散  因为制作透镜的材料中不可避免地会存在着微量的纯度缺陷，同时也受到加工精度限制等因素的影响，就使透镜产生的磁场不可能呈现绝对理想的轴对称。其结果致使透镜在垂直方向上的焦距会有所不同，由此带来的像差称为轴上像散.通常在电镜的聚光镜及物镜上各配装的一组消像散线圈，即是为弥补其而设。
    (5)影像畸变  这是由球差引起的另外一种像差，透镜边缘部分与中心部分的磁力线分布、会聚能力通常会存在差距，因而边缘光线与中心光线的成像平面不同，结果是物平面上的成像点距离光轴的远近变化能导致放大率随之改变。当边缘的放大率大于中心时，影像产生枕形畸变；反之当边缘的放大率小于中心时，影像产生桶形畸变（图4-9）。
 
图4-9 影象的畸变

    电镜制造时常通过选择透镜极靴形状和励磁强度，以尽量满足旁轴条件等方式来减少畸变像差。另外，电镜在低倍放大时影像畸变会较大一些，设计时可以使中间镜和投影镜的畸变互相补偿以尽量抵消畸变，而在高倍放大时影像畸变一般很小，可以忽略。
    以上介绍的各种像差都可能对电镜的成像质量、分辨率造成相应的影响消除只是相对而言，实际上是在某种程度上的减小，完全彻底地消除是不可能的。 

图4-10 成象过程中的景深与焦深
    六、成像过程中的景深与焦深
    图4-10在光学原理中，严格地说，只有绝对处在物平面上的点，才能被清晰地成像在像平面上。距离物平面越远的点，被成的像越是发虚模糊；对应的在成像端，距离像平面越远处所得到的像显然也是越模糊不清。从实像到发虚模糊是一个随距离连续渐变的过程，实与虚也是相对而言。如果我们设定在成像发虚只要不超过某一个程度时,便认为是“清晰”的，那么在物平面和像平面附近总有一个区域范围内，能得到满足所谓“清晰”的像。物平面前后能够“清晰”地成像的范围即Dｆo的长度值，被称为景深，有时亦称场深；同理，像平面前后能够获得“清晰”影像的范围，即Dｆi的长度值，被称为焦深。
    景深愈大愈易于聚焦，立体感也愈强。景深的大小在理论上与所要求的分辨力有关联，如要求分辨力很高，必须保证成像点的发虚模糊程度小，而满足这个程度的范围Dｆo会被压缩，此时景深就“变”小了。在实际使用中，景深又与通光孔径、像差消除的程度等因素有关，在透镜中增加光阑能够有效地拓宽景深和焦深的范围。焦深越大，能清晰成像的像平面(即焦平面)的误差宽容量也越大。焦深大小与放大倍数有关，放大倍数越大则焦深越大。电镜的焦深十分大，可达几十甚至几百米，所以电镜底片放在观察荧光屏的下方较远处，而并不影响成像的清晰度。这是光镜所不能比拟的。
    七、影像的反差与层次
    反差也称衬度或对比度。衬度，是指背景对影像主题结构的衬托，在黑白影像中，仅反映在明暗关系的对比上。如果让两个各着黑衣和白衣的人一同在雪地中，那么穿白衣者将被淹没在茫茫的白色之中，不易分辨，这就是衬度不好，反差太小的缘故，此时穿黑衣者却十分“抢眼”，因为黑与白的对比很强烈。反之，如果是在夜幕下，则效果刚好相反，穿黑衣者更加暗淡无光，穿白衣者却比较“醒目”。在显微镜的成像里，衬底与结构的反差越大，也越能 
图4-11 光阑与影象反差的关系
“泾渭分明”。
    那么，是不是影像的反差越大越好呢? 不然，反差太大只能看到强烈的黑与白,却损失了中间灰的结构。因为构成一幅影像不仅要有黑与白,还必须显现出中灰程度的细节才算完整，没有中灰程度细节的影像，就象美术手法中的“速写”或“版画”,仅能让人看到由黑与白构成的轮廓及形态。只有描绘上不同灰度的细节，才能让人感受到错落有致的细腻感，象美术手法中的“素描”或“炭粉画”，可以给人更为真实的感受。这种细腻感的体现，实质上是通过影像中的灰度等级数来反映的,灰度等级越多，我们便借用了一个术语叫做“层次”越丰富，反之，我们就认为层次太少。
    层次与反差的关系是矛盾的，反差过大会损失掉应有的层次。而层次过于丰富则衬托不出适度的反差，给人一种“无力”的不快感（不悦目），象在灰纸上用淡墨水写字，不易辨认。一幅影像即要有适度的反差，又要表现出较为丰富的层次才算是好的影像。样品结构的密度不同，反映出来的影像是由连续而不同的灰度等级构成，如何选择层次与反差的关系,而使之恰到好处，这要根据自己所要观察目标的侧重点来决定，其中也包含了个人的视觉习惯因素。
    电镜成像过程中影响层次与反差的因素很多，主要与样品制作和电镜观察条件有关。电镜成像过程中，电子束流与样品相互作用，除被阻挡和透过的电子外，还有一部分电子在轰击样品时，会与样品原子核发生“完全弹性碰撞”而被偏折出原来的运动路线。此外电子束中的高速电子还可能与样品原子核外的电子发生“非完全弹性碰撞”而发生方向和速度上的改变，这种现象称为散射。这种改变了方向或速度的电子被称为“散射电子”。碰撞机会越多，散射量也越大。散射电子方向上的改变，导致在不该成像的位置上成像；速度上的变化即能量发生变化则不能真实地反映出样品上相应点的密度信息。这些变化都势必要降低影像的反差，所以散射电子是影响反差的主要因素之一。采用在光路上施加光阑的办法，遮挡部分散射电子，尽量减少它对成像的参与程度，能显著地改善反差。图4-11（a）为光阑遮挡散射电子的示意图，图4-11（b）为未加光阑与施加不同孔径的光阑时，所获得不同反差影像的比照.
  

  图4-11光阑与影像反差的关系