第1节 电子显微镜概述

一、光学显微镜及其性能限制
    人们用肉眼观察细小物体所能看见的最小细节即人眼分辨率（resolving power）约0.2mm。17世纪光学显微镜(light microscope)的出现，打开了微观世界的大门，把人类的视野向微观世界深入了3个数量级(分辨率提高到0.2μm)， 看到了许多肉眼看不到的微小物体，如细胞、细菌和其他一些微生物。人类医学对自身的研究也随之从解剖学的领域深入到组织及细胞学的水平。
    光学显微镜可以简单地理解为两块透镜的组合，由于映入人眼的物像的放大率是这两块透镜放大率之积，似乎如此，若想进一步提高放大率，只要增加透镜的屈光度就行了，然而随着放大率的增加，首先便遇到透镜像差这个障碍。所谓透镜像差，即透镜本身存在的缺陷，它使所成的影像产生畸变、弯曲或其他像质下降现象。当放大率增加时，透镜的这些缺陷也随之扩大，物像也就变得模糊起来，这就失去了增加放大率的意义。要想完消除透镜的像差是做不到的，不过，现代光学透镜制作的技术水平可使像差保持在一个很小的数值内，从而使光镜可达到1000多倍的放大率，这也是光镜放大本领的极限。光镜的性能为什么会有这样一个难以超越的界限呢? 决定这个界限的因素是什么? 原来最主要的问题不在于显微镜本身，而是取决于作为成像媒介的光线性质。因为光存在着衍射效应，光镜下看不清直径小于可见光波长一半的物体。
    二、电镜的诞生和发展
    图4-1电磁波的传递过程 

图4-1 电磁波的传递过程

    1923年，法国科学家Louis de Broglie发现，微观粒子本身除具有粒子特性以外还具有波动性。他指出不仅光具有波粒二象性，一切电磁波和微观运动物质(电子、质子等)也都具有波粒二象性。电磁波在空间的传播如图4-1所示，是一个电场与磁场交替转换向前传递的过程。电子在高速运动时，其波长远比光波要短得多，于是人们就想到是不是可以用电子束代替光波来实现成像?
    1926年，德国物理学家H·Busch提出了关于电子在磁场中的运动理论。他指出：具有轴对称性的磁场对电子束来说起着透镜的作用。从理论上设想了可利用磁场作为电子透镜，达到使电子束会聚或发散的目的。
    有了上述两方面的理论，1932年，德国柏林工科大学高压实验室的M.Knoll和E.Ruska研制成功了第1台实验室电子显微镜，这是后来透射式电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）的雏形。其加速电压为70kV，放大率仅12倍。尽管这样的放大率还微不足道，但它有力地证明了使用电子束和电磁透镜可形成与光学影像相似的电子影像。这为以后电子显微镜的制造研究和提高奠定了基础。
    1933年，E.Ruska用电镜获得了金箔和纤维的1万倍的放大像。至此，电镜的放大率已超过了光镜，但是对显微镜有着决定意义的分辨率，这时还只刚刚达到光镜的水平。1937 年，柏林工业大学的Klaus和Mill继承了Ruska的工作，拍出了第1张细菌和胶体的照片，获得了25nm的分辨率，从而使电镜完成了超越光镜性能的这一丰功伟绩。
    1939年，E.Ruska在德国的Siemens公同制成了分辨率优于10nm的第1台商品电镜。由于E·Ruska在电子光学和设计第1台透射电镜方面的开拓性工作被誉为“本世纪最重要的发现之一”，而荣获1986年诺贝尔物理学奖。
    除Knoll、Ruska以外，同时其他一些实验室和公司也在研制电镜。如荷兰的菲利浦（Philip）公司、美国的无线电公司(RCA)、日本的日立公司等。1944年Philip公司设计了150kV的透射电镜，并首次引入中间镜。1947年法国设计出400kV的高压电镜。60年代初，法国制造出1500kV的超高压电镜。1970年法国、日本又分别制成3000kV的超高压电镜。
    进入60年代以来，随着电子技术的发展，特别是计算机科学的发展，透射电镜的性能和自动化程度有了很大提高。现代透射电镜（如日立公司的H-9000型）的晶格分辨率最高已达0.1nm，放大率达150万倍。人们借助于电镜不但能看到细胞内部的结构，还能观察生物大分子和原子的结构，应用也愈加广泛和深入。
    扫描电镜(scanning electron microscope, SEM)作为商品出现则较晚，早在1935年，Kn oll在设计透射电镜的同时，就提出了扫描电镜的原理及设计思想。1940年英国剑桥大学首次试制成功扫描电镜。但由于分辨率很差、照相时间过长,因此没有立即进入实用阶段， 至1965年英国剑桥科学仪器有限公司开始生产商品扫描电镜。80年代后扫描电镜的制造技术和成像性能提高很快，目前高分辨型扫描电镜（如日立公司的S-5000型）使用冷场发射电子枪，分辨率已达0.6nm，放大率达80万倍。
    我国从50年代初开始研制透射电镜，1959年第1台透射电镜诞生于上海新跃仪表厂，此后中型透射电镜开始批量生产。目前国产透射电镜分辨率已达0.2nm，放大80万倍。扫描电镜也于70年代开始生产。国内主要生产电镜的厂家是:北京中科院科学仪器厂、上海新跃仪表厂、南京江南光学仪器厂等。
    三、电镜和光镜的比较
    光镜和电镜不仅在体积大小、价格高低、使用条件等方面不同，而且在工作原理、仪器结构和性能方面也存在着很大差异。下面仅就主要方面进行比较。
    1.成像原理
    光镜是利用可见光透过标本成像于视网膜或胶片上，由于染色方法的不同，可获得不同颜色的彩色影像；电镜是利用“单色”电子束成像于荧光屏或胶片上,获得的是标本的密度像��黑白影像.
    2.透镜自身本质的差别
    光学透镜是由玻璃制成；而电子透镜不是肉眼可见的透镜，它是由磁或电所形成的磁场或电场的局部空间来起到透镜的作用。
    3.色差控制
    光学显微镜由于利用了各色波长混合而成的自然光，为此必须使用能消除由各色波长引起焦距变化的“消色差透镜”；而电子透镜本身则不承担消除色差的任务，而是通过精密地稳定加速电压、提高电子束的“单色性”，来解决电镜中的色 差问题。
    4.照明源
    光镜的照明源是可见光，包括自然光、灯光；电镜的照明源是由阴极产生的高速运动的电子束。
    5.光路
    电镜镜筒内部必须保持高真空，因此电镜具有复杂的真空系统；而光镜则无真空的要求。
    6.分辨率和放大倍数
    光镜最高分辨率是0.2μm，放大1000倍左右；而 电镜分辨率可达0.2nm，放大率达100万倍以上。
    7. 性能特点
    现将光镜和电镜的性能特点列表作一对比，见表4-1。
表4-1光镜和电镜的性能特点比较

四、电镜的类型及特点 
    电镜一般是由镜体(电磁透镜系统)和相应的辅助系统构成。出于对镜体的机械稳定性、重力和其他外界因素影响的考虑，通常是将镜筒采用直立的方式装配。由处于顶部的电子枪发射“光源”（电子束），下方配置适当的电磁透镜，按电镜的类型和工作方式的不同，安排不同性能的电磁透镜予以适当的匹配，通常电镜大致可分为3种类型 ：透射式电镜（TEM）、扫描式电镜（SEM）和扫描透射式电镜（STEM）。
    1.透射式电镜（TEM）
    透射电镜是靠穿透样品的电子束进行成像放大的，样品内部的结构是通过空间密度不同反映出来的，密度大的地方阻挡和吸收的电子多，透过电子少；结构稀疏处密度小，透过电子多。这样在透射电子束的横截面上电子密度的疏与密的分布便对应了样品结构密度的密与疏的关系，也就是说，透过电子束的密度变化也包含了样品结构的信息，见图4-2（a）。 透射式电镜研制最早，使用最为广泛。具有以下几个特点：①成像分辨率最高，现在研制的TEM 已达到0.1nm；②对样品厚度有一定要求，通常在30～50nm左右。太厚则电子束不易穿透 ,无法满足观察和拍摄时对亮度的要求，且样品结构重叠过多，会影响影像清晰度；样品太薄则影响对电子束照射轰击的耐受性，造成热损伤和污染；③放大率的范围相对来说较窄，由于透射工作方式的特点，一般不能从高倍率连续变化到很低的倍率，通常在几百倍以下放大时必须更换透镜的工作方式（由仪器自动切换）。
 

图4-2 2种基本类型的电镜

    2.扫描式电镜(SEM)
    扫描电镜是把电子束会聚成很细的束点，称为电子探针(实际上要远比针尖更为尖细得多)，象写字一样逐行逐点地在样品表面扫描，然后把激发出来的二次电子收集起来，将二次电子所携带的样品表面的信息处理成影像，在显示器上显现出来，成像的方式是间接的，见图4-2（b）。SEM的使用相当广泛，研制工艺也比较成熟。特点如下：①由于电子探针没有穿过样品内部，只在表面激发出二次电子， 所以主要被用来观察样品表面或断裂面的结构形态；②景深比TEM长，富有立体感；③放大率范围宽，可以从几十倍连续变化到几十万倍；④对样品制作要求简单，适应性强；甚至有些硬质干燥的样品几乎可以不用处理而直接观察；⑤由于电子探针不停地做扫描运动，不会长久地对样品上所有点同时轰击，所以对样品的损伤远比TEM小得多；⑥样品室活动范围大，对样品的大小、高度和形态的适应性强；TEM样品通常只能装载在直径3mm左右的铜网上，而SEM的样品室甚至可以容载下直径 10cm的样品；⑦分辨率低于同档次的TEM。
    3.扫描透射式电镜(STEM)
    扫描透射式电镜（scanning-transmission  electron microscope，STEM）也是利用电子探针在样品表面做扫描运动，但不接收二次电子，而是在样品另一面接收透过样品的透射电子，然后加以处理，显示出影像。最终像同SEM 一样显现在显像管的荧光屏上。特点为：①成像较好，分辨本领介于TEM和SEM之间；②与SEM一样，对样品的损伤小；③要求样品较薄，以易于穿透；④能将透射电子中的弹性散射电子与损失了一定能量的非弹性散射电子区别，加以对比分析处理，得到TEM和SEM检测不到的信息；⑤尤其便于与SEM结合做同一部位的观察对比。
    TEM和SEM是电子显微镜的2种最基本类型，应用较为普及。STEM的使用尚不是十分广泛，这种观察方式目前只在分析型电镜中使用，所谓分析型电镜即非单一的TEM，也非单一的SEM，是指综合了各种电镜的性能，能对多种电子信号进行综合分析处理的电子显微镜。
    五、电镜的工作条件
    1.对电源的要求
    无论哪类电镜，其根本能源来自于电。电镜属于较大型的耗能装置(若干千瓦以上)。电镜的启动在小型电网中会引起电压的波动，而电网中电压的波动会对电镜的使用带来很不利的影响。越是高性能的电镜，对电源电压的要求越高。电源不稳定会波及到电镜内部元件工作状态，影响电镜的分辨本领和操作性能。所以电镜的安装，必须选择负载能力强的电网，另外给电镜配置电子稳压器也是相应的措施之一。但是附近大型用电设备或含较大电感的用电设备，在启闭瞬间所产生的“浪涌电压”仍是电子稳压器所难以克服的。所以电镜的安装最好选用独立的供电线路，同时电镜还必须有良好的接地装置。地线对于电镜自身的电磁屏蔽和对操作者的安全都是至关重要的。
    2.供水要求
    电镜内部产热元部件较多，如扩散泵电炉、电磁透镜、大功率半导体器件等。所以电镜工作时要进行冷却，通常都采用水冷方式来降温，为保证充分的热交换，要求水压和流量要足够大，一般要达到4～5L/min以上的流量，0.5～2kg/cm2的压力。同时对水温也有一定要求(10～25℃之间)，太高对电镜冷却不够充分，太低则可能在冷水通道外壁造成水蒸汽的凝结，除对电镜的电气性能带来影响外，还可能引起锈蚀。冷却水的水质一定要软，电镜冷水通道“盘根错节”，管口细且接头多，过硬水质易在管道中结垢，清除起来十分困难。最好采用循环水装置对电镜进行降温冷却，该装置既能使电镜内流出的水降温，又能重复使用蒸馏水，同时达到避免结垢、节约用水的目的。
   六、电镜的工作环境
    1.防震
    电镜是一种高倍率放大的仪器，通常在几万到几十万倍的放大率下工作，任何因为震动所引起的细微变化，都可能通过高倍放大后显著地表现出来，其结果必然影响成像，导致分辨力的下降。尤其在拍摄超高分辨影像时，即使有人在旁边走动，都可能带来不良影响。所以电镜的制造者常常在设计时并不让电镜的镜体直接着地,而是在四角安装弹簧垫脚，以起到减震作用。而电镜的使用者在建造电镜室时又常将镜体安放处建成独立、坚固的地基，尽可能将由外界震动带来的影响减弱到最小程度。
    2.防磁
    电镜的成像放大过程是通过磁场对电子束折射来实现的，然而有用磁场的强度和方向则是经过精密设计的，任何外界电磁场都会起到干扰作用，也是应当竭力避免的。在我们周围，无论何处总是或多或少地分布着一些杂乱电磁场。电镜要求杂乱磁场的分布强度小于5×10-7T（特斯拉），因此最好在电镜工作室的四周装嵌金属屏蔽网。
    3.防尘
    这是任何精密仪器所要求的必需措施，电镜是机械与真空、电磁与电子线路的联合体，镜体内部要保持高度真空，外部电路要保证高稳定、高可靠性，对防尘的要求更不例外。
    4.恒温恒湿
    温度的变化会影响电路的稳定性以及机械部件吻合的严密性。湿度太大则不利于电气元件的绝缘性能，尤其对于带有上百千伏的高压元件，潮湿空气更具有危害性；湿度太低则易在绝缘部件上积聚高压电荷，产生静电。电镜工作室必须装备空调机和去湿机，使温度保持在15～25℃之间，湿度控制在70％以下。
    七、观察电镜的前后期工作
    1.严格的样品制作要求
    无论哪一种电镜样品制作方法，都应具备严格的工艺条件和良好的技术水平。这是一项必须有细心、耐心，容不得一丝马虎的工作，没有好的样品，就拍不出好照片，再好的电镜设备，再高的操作技术也是枉然。
    2.精细的后期暗室处理
    电镜的成像结果全部记录在感光胶片上，后期对结果的分析也依赖于电镜底片,所以电镜底片的冲洗印放等暗室工作也是十分重要的一个环节。暗室处理得好，可为电镜照片增辉，甚至能弥补拍摄过程中的某些不足；处理不好，则不能充分反映出电镜成像的最佳质量，严重的失误将造成前功尽弃及无可挽回的损失。故而配合电镜工作应当置备一个条件好的暗室，辅以精湛的暗室工作技术，高度重视每一个操作步骤。
    八、电镜成像技术在生物医学中的应用
    在生物医学领域内，电镜成像技术已渗入到各个学科，应用日益广泛。电镜技术不仅是医学基础形态学科研究中不可或缺的工具，而且为临床疾病的病理研究和诊断提供了更为宽广和深入的应用领域，这里仅举几例略作简单介绍。
    1.在细胞和分子生物学方面的应用
    电镜技术大大推动了细胞生物学的发展，把细胞学的研究更进一步提高到超微结构的水平。例如，对光镜下已经发现的细胞器如线粒体、中心体的结构和功能，在电镜下有了新的和更深入的了解；对光镜下争论不休的高尔基器，在电镜下得到了证实并作了深入的研究；在电镜下发现了许多新的细胞器和结构，如内质网微体，微管、微丝等。此外，电镜技术还对细胞的膜系统、细胞骨架和细胞连接的研究起着重要作用。近年来，采用多种电镜技术相结 ，使人们能够对细胞各部分的结构、代谢和功能联系起来，进行动态的研究，从而极大地丰富了细胞生物学的内容。
    电镜技术对分子生物学的研究也作了很大的贡献。例如，电镜对染色质和染色体的研究为分子遗传学提供了大量的形态依据；对核糖体的研究使蛋白质合成机制得到了较好的阐 明，对生物大分子的研究促进了遗传工程学科的发展等。
    2.在组织学中的应用
    电镜技术大大丰富了组织学的内容。例如，对于肌组织，电镜下揭示了肌细胞内粗丝和细丝的排列和结构，为阐明肌肉收缩的机理提供了形态学基础；对于神经组织，通过对突触超微结构的研究，使人们对神经细胞的结构和功能有了进一步了解；对于循环系统，透射电镜不仅能观察各种毛细血管的微细结构，而且扫描电镜的血管铸型技术还能研究毛细血管在各种组织和器官中的空间分布。总之，电镜技术已成为组织学研究中最重要的工具之一。
    3.在微生物学中的应用
    主要包括两个方面，一是对光镜下看得见的原虫、真菌、细菌等作进一步的超微结构研究；二是电镜技术对病毒学的发展起着重要的作用，如：① 发现和鉴定新的病毒；②研究病毒形态结构和在细胞内形态发育过程；③临床病毒性疾病的诊断，运用负染色技术和免疫电镜技术，可以协助病毒感染性疾病的诊断，如对天花、水痘、单纯疱疹痘泡液的检查；对一些很难进行组织培养的病毒（如肝炎病毒、轮状病毒）和不引起细胞明显病变的病毒（风 疹，鼻病毒），电镜往往是鉴定和诊断的可靠手段。
    4.在病理研究及临床诊断方面的应用
    电镜技术推动了超微结构病理学和诊断学的进展，比较突出的如： ①血液病研究。血细胞的超微结构研究已为贫血性疾病、血小板疾病、各种白血病的鉴别诊断提供了大量资料；②肿瘤研究，电镜技术可为肿瘤的诊断和病因研究提供资料, 对其他影像设备和光镜下不易确定的某些肿瘤，有时只有通过超微结构观察才能解决； ③肾病的研究。由于各种肾病的超微结构病变各具特点，肾活检标本的电镜观察有助于早期诊断。如根据肾小球基底膜的改变，结合其他超微结构病变将肾小球疾病进行新的分类，根据各种病变的特征可鉴别硬化性肾炎，先天性肾炎和抗原抗体复合物造成的免疫性肾病等； ④其他疾病的研究。如对肝脏、胃、肠、气管、皮肤、肌肉等疾病开展超微结构病理活检工作，获得了很多有价值的资料，对于疾病的诊断，特别是肿瘤的诊断很有意义。